Production de protéines recombinantes à haut débit : application aux facteurs de transcription de Ciona intestinalis

High throughput protein production : application to the Ciona intestinalis transcription factors

• Auteur / Autrice : Renaud Vincentelli
• Direction : Christian Cambillau
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé. Bioinformatique, Biochimie structurale et Génomique
• Date : Soutenance en 2009
• Etablissement(s) : Aix-Marseille 1
• Partenaire(s) de recherche : autre partenaire : Université de Provence. Section sciences

Mots clés

Mots clés contrôlés

Escherichia coli

Facteurs de transcription

Ciona intestinalis

Protéines recombinées

Résumé

La production de protéines solubles en quantité suffisante pour des études structurales ou fonctionnelles est aujourd’hui encore un défi. Le système le plus simple et le moins onéreux repose sur l’utilisation de la bactérie Escherichia coli (E. Coli). Cependant, sans optimisation la majorité des protéines est produite sous forme insoluble. Je vais décrire dans cette thèse des protocoles qui permettent de cribler l’expression et de purifier des dizaines de protéines par semaine. Ces méthodes permettent aussi d’augmenter jusqu'à cent fois le niveau d’expression soluble dans E. Coli par rapport aux protocoles classiques. Je présenterai la procédure choisie ainsi que son application à l’étude des domaines de fixation à l’ADN (DNA BD) des facteurs de transcription (TF) de Ciona intestinalis. Cet organisme est le modèle pour la première caractérisation du répertoire complet de spécificité des TF d’un génome de métazoaire. Notre protocole de purification a pu être appliqué à 450 protéines. La majorité des protéines a pu être purifiée et la spécificité de reconnaissance sur l’ADN des DNA BD a été caractérisée par un nouveau protocole de SELEX automatisé. Le résultat de leur caractérisation donne un répertoire de la spécificité de fixation sur l’ADN chez un chordé et suggère que ces motifs sont, en partie au moins, conservées chez les eucaryotes.

The production of soluble recombinant protein in suitable quantities for structural or functional studies is still a major challenge. The simplest and cheapest system for heterologous expression of recombinant proteins is Escherichia coli (E. Coli). Unfortunately, without optimization the majority of the proteins will be expressed in insoluble form. In this work, I will describe protocols that allow the expression screening and the purification of tens of proteins per week. These methods help to increase by up to a hundred fold the solubility level of recombinant proteins in E. Coli. I will present the final set up of this procedures and its application to the study of Ciona intestinalis transcription factors (TF) DNA binding specificity. This organism is a model for the first characterization of the full repertoire of DNA binding domains (DNA BD) specificity of all the transcription factors in a metazoan genome. A cheap and easy consensus production and purification protocol could be applied on the Ciona intestinalis 450 DNA BD. The vast majority of the DNA BD could be purified in milligram amounts and their DNA binding specificity was characterized in vitro by a newly designed automated SELEX assay. The result provides a global view of the repertoire of DNA-binding specificity in a chordate and suggests that these sequences are to some extend conserved with vertebrates.