Analyse quantitative et systématique de la dynamique spatio-temporelle de l'activité de la voie de signalisation ERK au cours de l'embryogenèse des ascidies

Quantitative and systematic analysis of the spatio-temporal dynamics of ERK signaling pathway activity during ascidian embryogenesis

• Auteur / Autrice : Kilian Biasuz
• Direction : Patrick Lemaire
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie Santé
• Date : Soutenance le 25/10/2022
• Etablissement(s) : Université de Montpellier (2022-....)
• Ecole(s) doctorale(s) : Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre de Recherche de Biochimie Macromoléculaire (Montpellier)
• Jury : Président / Présidente : François Fagotto
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Patrick Lemaire, François Fagotto, Clare Hudson, Romain Levayer, Charles Kervrann, Matteo Rauzi
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Clare Hudson, Romain Levayer

Mots clés

Mots clés contrôlés

Ascidies

Protéines

Cellules indifférenciées

Embryologie

Mots clés libres

Signalisation ERK

Imagerie quantitative in vivo

Biosenseur ERK-KTR

Atlas 4D cellule unique

Développement

Ascidie

ERK signalling

In vivo quantitative imaging

ERK-KTR biosensor

4D single cell atlas

Development

Ascidians

Résumé

Le succès de l'embryogenèse nécessite la formation des types cellulaires corrects dans des positions appropriées. Afin de prendre les bonnes décisions, les cellules communiquent en utilisant un répertoire conservé de facteurs de signalisation et de voies de transduction. La voie de signalisation ERK est l'une de ces importantes voies utilisée à de nombreuses reprises au cours du développement chez les animaux. Cependant, nous ne comprenons toujours pas comment la signalisation ERK participe à des fonctions aussi diverses. Il a été proposé que les caractéristiques de la dynamique spatio-temporelle codent en elles-mêmes la diversité des effets observés et une variété de cinétiques d'activité de ERK est maintenant observée dans de nombreux types de cellules ou en réponse à différents stimuli. Ainsi, bien que l’étude de la dynamique de l'activité ERK au cours du développement soit essentielle pour approfondir notre compréhension du fonctionnement de cette voie et de son impact sur les comportements cellulaires, les études quantitatives de l'activité ERK à la résolution cellulaire dans des embryons vivants commencent seulement à émerger et notre compréhension reste limitée à quelques éléments non reliés entre eux.L'étude de la voie ERK chez les vertébrés est complexifiée par la duplication de leurs génomes et la présence de multiples paralogues. Ainsi, pendant mon doctorat, j’ai étudié la voie ERK chez les ascidies, de petits invertébrés marins membres des tuniciers, groupe frère des vertébrés. Ces animaux possèdent des gènes uniques des composants de la voie ERK et l’utilisent pour contrôler de nombreux évènements d’inductions au cours de leur embryogenèse. Les embryons de l'ascidie Phallusia mammillata ont deux autres propriétés favorables : ils sont petits et entièrement transparents, donc faciles à imager, et ils se développent rapidement avec des lignages cellulaires invariants, de sorte que chaque cellule peut être nommée et trouvée à la même position, ce qui fournit un cadre rigoureux pour des analyses à la résolution cellulaire. De plus, avant le début de mon doctorat, notre équipe a développé une capacité unique à identifier/segmenter/suivre les cellules au cours du développement de Phallusia.Mon projet de thèse a donc combiné imagerie quantitative in vivo, informatique, modélisation théorique et perturbations expérimentales afin d’étudier de façon quantitative et systématique la dynamique spatio-temporelle de la voie de signalisation ERK au cours de l’embryogénèse de Phallusia. Je me suis tout d’abord concentré sur le développement des méthodologies expérimentales permettant la quantification manuelle in vivo de l’activité ERK au stade 64-cellules en utilisant le biosenseur ERK-KTR. Comme preuve de principe, nous avons utilisé cet outil dans le cadre de la révision d’un article visant à tester l’hypothèse selon laquelle les surfaces de contact entre cellules émettrices et réceptrices fournissent les informations quantitatives qui déterminent le résultat des inductions chez les ascidies. J’ai ensuite participé à l’élaboration d’un cadre théorique et des méthodes algorithmiques permettant d’identifier et de nommer automatiquement chaque cellules des embryons reconstruits de Phallusia. En connectant les embryons dans un référentiel commun, ce travail établit les embryons stéréotypés d'ascidies comme un cadre numérique de choix pour construire et intégrer des atlas 4D fonctionnels à la résolution cellulaire. Enfin, je me suis concentré sur le développement et à la validation de la méthodologie permettant de mesurer automatiquement l’activité de ERK pour chaque cellule d’embryons vivants de Phallusia toutes les 2 minutes. L’ensemble de ce travail permettra d'identifier de nouvelles inductions et d’étudier la variabilité de la signalisation ERK entre embryons en lien notamment avec la variabilité des contacts cellulaires afin de tester la généralité du modèle d’induction surface-de-contact dépendant chez les ascidies.

Successful embryogenesis requires the formation of the correct cell types in appropriate positions. In order to make the right decisions, cells communicate using a conserved repertoire of signalling factors and transduction pathways. The ERK signalling pathway is one of these important pathways that is used repeatedly during development in animals. However, we still do not understand how ERK signalling is involved in such diverse functions. It has been proposed that the characteristics of the spatio-temporal dynamics themselves encode the diversity of effects observed and a variety of kinetics of ERK activity is now observed in many cell types or in response to different stimuli. Thus, although the study of the dynamics of ERK activity during development is essential to further our understanding of the function of this pathway and its impact on cellular behaviour, quantitative studies of ERK activity at cellular resolution in living embryos are only beginning to emerge and our understanding remains limited to a few unrelated elements.The study of the ERK pathway in vertebrates is complicated by the duplication of their genomes and the presence of multiple paralogs. Thus, during my PhD, I studied the ERK pathway in ascidians, small marine invertebrates that are members of the tunicates, the sister group of vertebrates. These animals possess unique genes for each component of the ERK pathway and use this pathway to control many induction events during their embryogenesis. Embryos of the ascidian Phallusia mammillata have two other favourable properties: they are small and fully transparent, thus easy to image, and they develop rapidly with invariant cell lineages, so that each cell can be named and found at the same position, providing a rigorous framework for analyses at cellular resolution. In addition, prior to the start of my PhD, our team developed a unique ability to identify/segment/track cells during Phallusia development.My thesis project therefore combined quantitative in vivo imaging, computer science, theoretical modelling and experimental perturbation to quantitatively and systematically study the spatio-temporal dynamics of the ERK signalling pathway during Phallusia embryogenesis. I first focused on the development of experimental methodologies allowing the manual in vivo quantification of ERK activity at the 64-cell stage using the ERK-KTR biosensor. As a proof of principle, we used this tool as part of a paper review to test the hypothesis that contact surfaces between transmitter and receiver cells provide the quantitative information that determines the outcome of inductions in ascidians. I then participated in the development of a theoretical framework and algorithmic methods to automatically identify and name each cell in reconstructed Phallusia embryos. By connecting the embryos into a common repository, this work establishes stereotyped ascidian embryos as a numerical framework of choice for building and integrating functional 4D atlases with cellular resolution. Finally, I focused on the development and validation of the methodology to automatically measure ERK activity for each cell of living Phallusia embryos every 2 minutes. This work will allow us to identify new ERK-dependent inductions and to study the variability of ERK signalling between embryos in relation to the variability of cell contacts in order to test the generality of the surface-contact dependent induction model in ascidians.