Contribution aux études structurales des récepteurs de chimoikines CCR5 et CXCR4, principaux co-récepteur du VIH-1 exprimés en système levure et en cellule d'insecte

Contribution to the structural studies of the chemokine receptors CCR5 and CXCR4, the most important HIV-1 co-receptors, expressed in yeast or in insect cells

• Auteur / Autrice : Valérie Klein
• Direction : Franc Pattus, Jean-Luc Galzi
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
• Date : Soutenance en 2005
• Etablissement(s) : Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008)

Mots clés

Mots clés contrôlés

VIH (virus)

Drosophila melanogaster

Levure (agent de fermentation)

Médicaments -- Conception

Récepteurs

Chimiokines

Résumé

Les 39 millions de personnes infectées par le VIH/SIDA dans le monde, le coût des traitements, l’émergence de souches virales résistantes et les effets secondaires lourds soulignent la nécessité de trouver rapidement de nouveaux traitements. Une stratégie serait de bloquer l’entrée du virus dans les cellules de l’hôte. Parmi les différents partenaires impliqués dans l’entrée du virus, les récepteurs de chimiokines CCR5 et CXCR4, appartenant à la superfamille des RCPG, sont les deux principaux co-récepteurs du VIH-1. La conception de molécules à effet thérapeutique assistée par ordinateur est l’une des voies envisageables. Cette approche nécessite toutefois d’obtenir la structure 3D de la protéine, ce qui s’avère très complexe dans les cas des RCPG. En effet, ces récepteurs sont naturellement très faiblement exprimés, d’où la nécessité de développer des systèmes d’expression permettant d’obtenir les quantités de protéine pures et actives nécessaires aux études structurales envisagées. Ces récepteurs ont d’abord été exprimés dans la levure méthylotrophe H. Polymorpha, en adressant les protéines surexprimées vers les membranes des péroxisomes. Même si les taux d’expression semblaient prometteurs, les récepteurs produits dans ce système ne lient pas leurs ligands, et semblent former des agrégats indissociables après solubilisation. Nous avons donc testé un nouveau système, basé sur une expression stable et inductible dans les cellules S2 de D. Melanogaster. Les récepteurs ont été fusionnés à l’EGFP pour faciliter les étapes de détection, de quantification et de purification, mais aussi pour développer un test FRET afin de vérifier la fonctionnalité des récepteurs ainsi produits. Le FRET détecté entre EGFP. CXCR4 et SDF-1. TR prouve que les récepteurs sont produits sous forme fonctionnelle dans ce système. Par ailleurs, les récepteurs sont solubilisés par le NP-40 et les quantités de récepteurs obtenus (mg/L) sont compatibles avec les études structurales envisagées.

The 39 millions AIDS infected patients worldwide, the cost of the treatments, the emergence of resistant viral strains and the heavy side effects underline the need for finding new treatments. A new strategy could be to block the virus entry in the host cells. Among the different molecular partners involved in the virus entry, the chemokine receptors CCR5 and CXCR4 belonging to the GPCR superfamily are known to act as the principal HIV-1 co-receptors. These receptors are thus representing ideal targets for entry-blocking drugs and computer-assisted drug design could be a way of choice to discover such molecules. This approach requires however to obtain the 3D structure of the proteins, which is very complex especially in the case of GPCR. Actually, these receptors are naturally very poorly expressed, and efficient and reliable heterologous expression systems are still to be developed to obtain the large quantities of pure and active proteins needed for the structural studies considered. These receptors were first produced in the methylotrophic yeast H. Polymorpha, by targeting the overexpressed proteins towards the membranes of peroxisomes. Even if the expression levels were rather promising, ligand-binding activities of the produced receptors were not measurable and moreover, the receptors were always aggregating after solubilization attempts. Therefore we tested a new system, based on a stable and inducible expression in D. Melanogaster S2 cells. The receptors were N-terminally fused to EGFP as a tag, in order to facilitate the steps of detection, quantification and purification, but also to develop a FRET test in order to check the functionality of the receptors thus produced. The FRET detected between EGFP. CXCR4 and SDF-1. TR proved that the receptors can be functionnaly expressed in this system. Moreover, the receptors could be solulilized by NP-40, and the amounts of protein obtained in this system (mg/L) are compatible with the structural studies considered.