Influence de la dynamique du champ électrique sur l'efficacité de l'électroperméabilisation de la membrane cellulaire

• Auteur / Autrice : Tadej Kotnik
• Direction : Lluis Maria Mir, Damijan Miklavčič
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biophysique
• Date : Soutenance en 2000
• Etablissement(s) : Paris 11
• Jury : Président / Présidente : François Eschwege
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Damijan Miklavčič, François Eschwege, Eberhard Neumann, Justin Teissié, Tadej Bajd, Boštjan Žekš
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Eberhard Neumann, Justin Teissié

Mots clés

Mots clés contrôlés

Électroporation

Champs électriques

Techniques des impulsions (électronique)

Membrane cellulaire

Bioélectrochimie

Mots clés libres

Voltage transmembranaire induit

Perméabilisation membranaire

Impulsion électrique

Champ électrique dynamique

Résumé

L'électroperméabilisation est une méthode établie pour permettre l'internalisation des molécules exogènes dans les cellules en suspension et dans les tissus. Dans beaucoup d'applications, expérimentales et cliniques, il est très important que le pourcentage des cellules perméabilisées, le pourcentage des cellules survivantes, et souvent aussi la quantité de molécules internalisées, soient tous aussi élevés que possible. Pour améliorer l'efficacité des protocoles d'électroperméabilisation, le rôle de l'amplitude, de la durée et du nombre d'impulsions ont été étudiés en détail. Par contre, les études de l'influence de la forme de l'impulsion sur l'efficacité de l'électroperméabilisation ont été très rares, ce qui est en partie dû au manque de générateurs d'impulsions de haut voltage d'une forme autre qu'exponentielle ou rectangulaire. Le but principal de la recherche décrite dans cette thèse était d'étudier le rôle de la forme des impulsions dans l'efficacité de l'électroperméabilisation des cellules en suspension. Pour établir une base théorique pour les études expérimentales, nous avons développé une méthode d'analyse du voltage transmembranaire induit par des champs électriques qui varient au cours du temps. Nous avons également analysé le rôle des conductivités du milieu extracellulaire, de la membrane et du cytoplasme, et aussi du rayon et de la forme des cellules sur le voltage transmembranaire induit. Pour générer des impulsions ayant différentes formes, nous avons construit un système composé d'un générateur de fonctions programmable commercial et d'un amplificateur bipolaire à haute fréquence et à haut voltage. Concernant la détermination du pourcentage de cellules électroperméabilisées, nous avons développé une nouvelle méthode basée sur la bléomycine, un agent cytotoxique qui ne peut pas diffuser à travers une membrane plasmique intacte et qui mène ainsi à la mort sélective des cellules perméabilisées. Cette méthode élimine plusieurs des inconvénients de la méthode la plus communément utilisée, celle basée sur l'iodure de propidium. Nos expériences nous permettent de confirmer que pour des impulsions rectangulaires monophasiques, la perméabilisation augmente et la survie diminue avec l'augmentation de la durée et du nombre d'impulsions. Pour l'internalisation des petites molécules exogènes, nous montrons que le nombre d'impulsions joue un rôle plus important que la durée d'impulsion. Nous montrons aussi que la perméabilisation et l'internalisation des petites molécules exogènes provoquées par les impulsions biphasiques sont augmentées par rapport à des impulsions monophasiques de durée et d'amplitude identiques. Par contre, la survie obtenue avec des impulsions biphasiques est très similaire à celle réalisée par des impulsions monophasiques. Ces effets peuvent être expliqués sur la base de l'asymétrie du voltage transmembranaire total en raison du voltage transmembranaire de repos. Les impulsions biphasiques compensent cette asymétrie, et en plus elles permettent de délivrer une charge équilibrée au niveau des électrodes, réduisant la contamination électrolytique. Dans la gamme des temps de montée et de descente des impulsions rectangulaires de 2 µs à 100 µs, nous n'avons trouvé aucune influence de ces temps dans l'efficacité de l'électroperméabilisation. Nos résultats suggèrent aussi qu'un des paramètres très importants pour l'électroperméabilisation est la durée sans interruption pendant laquelle l'impulsion dépasse une certaine intensité critique.