Marquage irreversible du recepteur gaba#a

• Auteur / Autrice : MARIE-JEANNE BOUCHET
• Direction : Maurice Goeldner
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Psychologie
• Date : Soutenance en 1996
• Etablissement(s) : Strasbourg 1

Résumé

L'objectif de notre recherche est le marquage irreversible du site de liaison de l'acide -aminobutyrique (gaba#a) en vue de sa caracterisation moleculaire. Le recepteur ionotrope gaba#a est un hetero-oligomere regroupant autour d'un canal chlorure plusieurs sites de liaison qui interagissent entre eux: gaba, benzodiazepine, canal, barbiturates, steroides, ainsi que d'autres moins bien definis. Le recepteur gaba#a aurait une structure pentamerique, composee d'au moins trois des seize sous-unites ( 1-6, 1-4, 1-3, , p1-2) que la biologie moleculaire a permis mettre en evidence a ce jour, sans qu'une (ou des) composition(s) definie(s) aient pu etre attribuees aux recepteur(s) natif(s) qui possede(nt) vraissemblablement une grande heterogeneite de constitution. La pharmacologie complexe du recepteur gaba#a, probablement liee a sa structure moleculaire, pourra etre mieux comprise lorsque les proteines receptrices auront ete caracterisees et la topologie des differents sites de liaison mieux cernee: c'est le but du marquage irreversible qui consiste a etablir une liaison covalente entre le recepteur et un ligand portant une fonction reactive en l'absence (marquage d'affinite) ou en presence de lumiere (marquage de photoaffinite). Nous avons synthetise une quinzaine de molecules photoactivables portant quatre fonctions photosensibles differentes. Trois d'entre elles ont ete retenues en fonction de leurs caracteristiques physico-chimiques, de leur stabilite en milieu physiologique et de leur affinite pour le recepteur: l'acide 2-diazo-4-(5)-imidazole acetique 35, le chlorure de m-sulfonate benzene diazonium (msbd) 41 et l'azidopyridazinyl-gaba 49 sont des marqueurs irreversibles du recepteur gaba#a. Les deux derniers ont ete retenus pour etre synthetises sous forme radioactive en raison de leur stabilite en presence du recepteur membranaire. L'azidopyridazinyl-gaba 49 (ic#5#0=6. 10#-#7 m) est un marqueur de photoaffinite efficace dont l'analogue radioactif permettra une etude topologique du recepteur par marquage de la proteine et sequencage des elements proteolyses et purifies. Le msbd est un marqueur d'affinite puissant dont le caractere d'antagoniste non-competitif a ete mis en evidence par electrophysiologie. Une methode de dissociation efficace a permis de caracteriser sa liaison irreversible avec le recepteur gaba#a membranaire par etude des cinetiques de marquage et d'acceder ainsi a sa constante de dissociation. Le radioligand #3hmsbd marque quatre bandes proteiques dont le poids moleculaire correspond a celui de sous-unites et du recepteur. Le msbd pourra, en raison de ses caracteristiques d'affinite, etre utilise soit sous forme radioactive de maniere classique comme l'azidopyridazinyl-gaba 49, soit sous forme non-radioactive comme marqueur d'un recepteur ayant subi des mutations choisies en fonctions de criteres bien particuliers