Analyse fonctionnelle du promoteur du gene c4 et identification de son activateur transcriptionnel b-hlh-zip

Functional analysis of the c4 promoter gene and identification of its b-hlh-zip transcriptional activator

• Auteur / Autrice : Marie-Dominique Galibert
• Direction : TOMMASO MEO
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie
• Date : Soutenance en 1996
• Etablissement(s) : Paris 6

Résumé

La proteine c4, produit du gene c4, constitue le quatrieme composant du complement, dont le role est capital puisqu'il est l'effecteur principal de la reponse immunitaire contre les micro-organismes. La regulation transcriptionnelle des genes c4 offre un modele unique d'etude, de part une expression complexe et specifique de tissu, dependante en partie de la presence de mediateurs de la phase aigue de l'inflammation. La comprehension des differents modes d'expression repose pour une part sur l'etude fine de l'anatomie des promoteurs des genes c4. L'analyse des relations structure-fonction des promoteurs des genes c4 (-119/+49), de souris et de rat, dans la mesure ou ces especes partagent une identite nucleotique de 99,5% pour la region (-119/+49), nous a permis de localiser en -1/+12 un motif inr, qui se substitue a la sequence initiatrice de type boite tata, en fixant le demarrage de la transcription. La force du promoteur a ete, quant a elle, principalement attribuee a deux sequences activatrices, le motif nf-1 like (ctgggcctagggccag) et la boite e de classe b (cacgtg) localises, respectivement en -108/-93 et 75/-70, en amont du site d'initiation de la transcription (+1). L'implication de la courte sequence palindromique (cacgtg) dans le niveau de transcription du gene c4 (60%) et son association avec un motif inr, dans un promoteur depourvu de boite tata, nous a conduit a etudier puis purifier les complexes motif e/ligand. Trois etapes de purification biochimique, a partir d'extraits nucleaires de foie de rat, nous ont permis d'isoler deux proteines de 44 et 45 kda (facteur d'enrichissement : 10296), specifique du motif e du promoteur du gene c4. Les analyses aminoterminale (par microsequencage, respectivement sur 12 et 32 etapes) et carboxyterminales (anticorps, etudes des transcrits arnm) ont montre une parfaite identite de sequence entre elles et avec la proteine usf-1 humaine (43 kda), de la famille des proteines b-hlh-zip, identifiee dans des extraits nucleaires de cellules hela. De plus, l'attribution des differentes proprietes -selectivite de site, poids moleculaire, thermosensibilite, extraction sel specifique- a chacune des proteines purifiees, nous permet de considerer la proteine p44 de rat comme l'homologue de la proteine usf-1 humaine (98% d'identite en acides amines), et la p45 comme une forme nouvelle de cette meme proteine. Ces donnees nous ont donc conduit a rechercher le mecanisme generant ces deux proteines, qui sont toutes les deux presentes dans differents types d'extraits nucleaires de rat et de souris (foie, rein, rate), alors que la proteine p45 n'a pas ete mise en evidence jusqu'a present, dans des extraits nucleaires humains prepares a partir de cellules hela et hepg2. Nous avons rejete l'hypothese de deux genes ainsi que celle d'un mecanisme d'epissage alternatif a l'origine de ces deux formes. La proteine p45 resulterait d'une modification post-traductionnelle de la proteine usf-1, vraisemblablement une phosphorylation. Par ailleurs, des etudes structurales, portant sur les complexes adn/proteine, suggerent que les proteines p44 et p45, presentes dans les extraits nucleaires bruts, ne consitituent pas deux sous-unites d'une meme molecule. Elles semblent s'homodimeriser preferentiellement, sans exclure cependant la formation d'heterodimere. Les complexes adn/proteine dimeriques constituent vraisemblablement la base d'une architecture plus complexe d'ordre tetramerique (environ 250kda, visualise apres migration des complexes adn/proteine dans un gel natif, en gradient), qui requiert l'integrite des domaines leucine zipper.