Pathologie moléculaire de la sclérose latérale amyotrophique

Molecular Pathology of Amyotrophic Lateral Sclerosis

• Auteur / Autrice : Aleksandra Chudinova
• Direction : Serge Lumbroso
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie Santé
• Date : Soutenance le 22/10/2021
• Etablissement(s) : Montpellier
• Ecole(s) doctorale(s) : Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut des neurosciences de Montpellier
• Jury : Président / Présidente : Patrick Vourc'h
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Serge Lumbroso, Patrick Vourc'h, Sorana Ciura, Adèle Faucherre
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Patrick Vourc'h, Sorana Ciura

Mots clés

Mots clés contrôlés

Phénotype

Génotype

Sclérose latérale amyotrophique

Mots clés libres

Sclérose Latérale Amyotrophique

Génétique

Relation génotype/phénotype

Amyortophic Lateral Sclerosis

Getetics

Genotype/phenotype relationship

Résumé

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie fatale qui provoque la dégénérescence des motoneurones. La génétique est considérée comme un facteur de risque pour développer la maladie et les patients sont conseillés à effectuer un diagnostic moléculaire pour rechercher un variant génétique causal. Ce diagnostic s’effectue sur un panel de gènes associés à la SLA. Tous les variants sont analysés d’après un système international pour leur attribuer une classe de pathogénicité parmi les 5 clases: Bénin (B), Probablement Bénin (PB), Variant de signifiance indéterminé (VUS), Probablement Pathogène (PP) et Pathogène (P). La présence de variants rares dans les séquences des patients pose un défi majeur au diagnostic, car il n’existe pas d’éléments pour les classer comme définitivement pathogènes. Notamment ce sont souvent des variants absents des bases de données et pour lesquelles il n’y a pas d’études fonctionnelles démontrant leur lien avec la pathologie. En conséquence, ils se retrouvent dans une classe VUS ou PP. L’analyse fonctionnelle des variants est un élément fort qui permet dans certains cas de redéfinir la classe de pathogénicité de ces variants.Dans ses travaux de thèse nous avons étudié l’effet fonctionnel de la surexpression de 4 variants dans le gène SOD1 et de 1 variant candidat dans le gène OPTN chez l’embryon du poisson zèbre ou zebrafish (Danio rerio). Le gène SOD1 qui code pour l’enzyme superoxyde dismutase est responsable de 20% des cas de SLA familiale. Les mutations dans ce gène sont majoritairement de type gain de fonction et provoquent la formation d’agrégats protéiques toxiques pour la cellule. Enfin, le gène SOD1 est une des cibles majeures de la thérapie génique par antisens. Les variants choisi dans ce gène sont : D126N, K137*, E134del et I150M. L’effet de leur surexpression est comparé avec les variants pathogènes A5V et G94A ainsi qu’avec le variant SOD1 WT. Le gène OPTN est un gène mineur de la SLA qui code pour une protéine impliquée dans le transport cellulaire, le maintien de l’intégrité de l’appareil de Golgi et la réaction inflammatoire par inhibition du facteur nucléaire NF-kappaβ. Les formes mutées de ce gène alternent sa fonction et sont observés de provoquer la formation d’agrégats. Le variant candidat de ce gène est le L429R, il est comparé avec le variant pathogène E478G et le variant OPTN WT. La surexpression des variants candidats et des variants pathogènes chez le zebrafish induit des défauts locomoteurs à 2 jours post fécondation (jpf). Une diminution de l’activité motrice est également à 5jpf pour certains variants. En outre, le phénotype locomoteur à 2jpf à est associé avec un raccourcissement des axones des motoneurones et des perturbations de la jonction neuromusculaire. Cette première caractérisation fonctionnelle montre que tous les variants candidats ont un effet pathogène et suggèrent de les reclassifier dans la classe Pathogène. Enfin, cette étude montre que le zebrafish peut s’utiliser comme un outil rapide pour cribler la pathogénicité des variants rares et appuie son potentiel pour le diagnostic moléculaire de la SLA.

Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that leads to motoneuron degeneration. Genetics is considered a risk factor for the development of the disease so patients are advised to undergo molecular diagnosis in research for a disease causing variant. The molecular diagnosis is performed on a panel of ALS associated genes. All variants are classified according to an international classification system defining five pathogenic classes: Benign (B), Probably Benign (PB), Variant of unknown Significance (VUS), Probably Pathogenic (PP) and Pathogenic (P). The presence of rare variants in patients’ sequences represents a major challenge for molecular diagnosis because there are not enough elements allowing to classify them as either pathogenic or benign. Often they are absent from databases and there is no functional evidence about their involvement in the disease. In consequence, they are classified as VUS or PP. Functional analysis of the variants is a strong classification element and in some cases it allows to redefine the pathogenic class of variants.In the current thesis work, we analysed the functional effect induced by overexpression of 4 candidate variants from SOD1 gene and 1 candidate variant OPTN gene in zebrafish (Danio Rerio) embryos. SOD1 codes for the enzyme superoxyde dismutase 1 and is responsible for 20% of familial ALS cases. There are mainly gain of function mutations in that gene, provoking the aberrant aggregation of the proteins which is toxic for the cells. Lastly, SOD1 is one of the major targets for antisense gene therapy. The candidate variants that we selected in that gene are: D126N, K137*, E134del et I150M. The effect of their overexpression is compared with the known pathogenic variants A5V and G94A, as well as with the WT variant. The gene OPTN is a minor ALS gene that codes for a protein implicated in the cellular trafficking, in Golgi apparatus maintenance as well as in the inflammatory reaction by inhibiting NF- kappaβ. The mutated variants of this gene alternate its function and also lead to formation of toxic aggregates. The candidate variant of this gene is L429R, its effect is compared with the known pathogenic E478G and with the OPTN WT variant. Overexpression of candidate and of pathogenic variants in zebrafish embryos induces locomotor impairments in 2-days post fertilization (dpf) Reduction of locomotor activity is seen for some larvae at 5dpf. In addition, locomotor phenotype from 2dpf is associated with shortening of the axonal projection of motoneurons and defects of the neuromuscular junction. This first phenotypical characterisation show that candidate variants have a pathogenic effect and suggest to reclassify them in the Pathogenic class. Lastly, this study shows that zebrafish can be used as a rapid tool for pathogenicity screening of rare variants and underlies its potential for ALS molecular diagnosis.