Étude du rôle des G-quadruplexes et de leurs protéines d'interaction chez Plasmodium falciparum

Deciphering the role of G-quadruplexes and their interacting proteins in malaria parasite Plasmodium falciparum

• Auteur / Autrice : Pratima Gurung
• Direction : Juan José Lopez Rubio, Artur Scherf
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie Santé
• Date : Soutenance le 16/04/2020
• Etablissement(s) : Montpellier
• Ecole(s) doctorale(s) : Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé (Montpellier ; Ecole Doctorale ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratory of Pathogen Host Interactions (Montpellier)
• Jury : Président / Présidente : Rosemary Kiernan
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Juan José Lopez Rubio, Artur Scherf, Rosemary Kiernan, Alfred Cortès Closas, Sara Richter, Katrin Paeschke
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Alfred Cortès Closas, Sara Richter

Mots clés

Mots clés contrôlés

Plasmodium falciparum

G-quadruplexes

Paludisme

Mots clés libres

Adn

Paludisme

G-Quadruplex

Plasmodium falciparum

Dna

Malaria

G-Quadruplex

Plasmodium falciparum

Résumé

Le paludisme continue d'être l'une des principales causes de morbidité et de mortalité dans les pays en développement. Le développement de la résistance aux médicaments antipaludiques disponibles et la rareté des vaccins efficaces ont rendu nécessaire la recherche urgente de nouvelles cibles antipaludiques. La forme grave du paludisme est causée par Plasmodium falciparum, qui présente un cycle de vie complexe impliquant diverses formes morphologiquement et fonctionnellement distinctes chez deux hôtes différents - l'humain et le moustique anophèle. Afin de se développer dans l'environnement de deux hôtes distincts, ces parasites utilisent différents mécanismes pour réguler leur expression génétique étroitement coordonnée. Ce projet de thèse se concentre sur l'exploration de cette régulation, qui est médiée par des structures secondaires d'ADN riches en guanine, principalement des G-quadruplexes. Ces structures se trouvent dans une large gamme d'organismes et sont impliquées dans la régulation des gènes tels que la transcription, la réplication de l'ADN et la maintenance télomérique. Récemment, on a découvert qu'elles sont également impliquées dans le processus de virulence pour échapper à la réponse immunitaire de l'hôte dans de nombreux pathogènes tels que les bactéries, les protozoaires et les virus. Chez Plasmodium, les motifs formant le quadruplex-G sont enrichis dans les régions télomériques et sous-télomériques, où les gènes de virulence sont présents. L'existence de G4 dans le génome de ces parasites riches en AT indique leur rôle dans le mécanisme de régulation des gènes et de variation antigénique. Cependant, il y a un manque de preuves expérimentales pour appuyer cette hypothèse. Le but de ce projet est de fournir la première étude complète de l'interactome G4 afin de comprendre le rôle des mécanismes de régulation médiés par le G4 dans la biologie du Plasmodium. En utilisant une combinaison d'approches non biaisées (levure hybride et test d'ADN pull-down), nous avons identifié ~152 protéines interagissant potentiellement avec les motifs G4 Plasmodium falciparum. Il a été démontré que les orthologues de certaines de ces protéines interagissent avec les G4, ce qui renforce nos résultats. De plus, pour comprendre comment ces candidats contribuent aux processus de régulation médiés par les G4, nous avons sélectionné et caractérisé deux protéines (GBP2 et DNAJ) pour effectuer des études fonctionnelles après validation de leurs propriétés de liaison. Il est démontré que ces protéines jouent un rôle important dans la biologie du Plasmodium. Dans cette étude, nous avons découvert que la GBP2 est une protéine dispensable qui interagit avec la G4 sélectionnée. Même si la délétion du gène n'est pas mortelle pour les parasites, elle affecte toujours l'expression des gènes var. Alors que l'ADNJ putatif est une protéine essentielle et que sa délétion entraîne l'arrêt des parasites aux derniers stades du cycle érythrocytaire. Collectivement, cette étude fait la lumière sur ce mécanisme de régulation basé sur la structure de l'ADN, encore peu étudié, et fournit la première étude systématique de l'interactome G4. Etant donné leur rôle essentiel dans le développement des parasites, une caractérisation plus poussée des candidats obtenus permettra probablement de générer de nouvelles cibles pour les antipaludiques qui contribueront à long terme à l'éradication de la maladie.

Malaria continues to be one of the major causes of morbidity and mortality in the developing countries. The development of the resistance against the available antimalarial drugs and scarcity of effective vaccines have demanded the urgent need of finding new antimalarial targets. The severe form of malaria is caused by Plasmodium falciparum, which manifests a complex life cycle involving various morphologically and functionally distinct forms within two different hosts - human and Anopheles mosquitoes. In order to thrive in two distinctive host’s environment, these parasites employ different mechanisms to regulate their tightly coordinated gene expression. This thesis project is focused on exploring the regulation, which is mediated by guanine-rich DNA secondary structures, predominantly G-quadruplexes. These structures are found in wide range of organisms and are involved in gene regulation such as transcription, DNA replication and telomeric maintenance. Recently, they are also found to be involved in the process of virulence to evade the host’s immune response in numerous pathogens such as bacteria, protozoa and viruses. In Plasmodium, the G-quadruplex forming motifs are found to be enriched in the telomeric and sub-telomeric regions, where the virulence genes are present. The G4 existence in these AT biased genome points towards their role in the mechanism of gene regulation and antigenic variation. However, there is a lack of experimental evidence to support this hypothesis. The aim of this project is to provide the first comprehensive survey of the G4-interactome in order to understand the role of G4-mediated regulatory mechanisms in Plasmodium biology. Using a combination of unbiased approaches (Yeast one-hybrid and DNA pull-down assay), we have identified ~152 putative G4 interacting proteins in Plasmodium falciparum. The orthologs of some of these proteins were shown to interact with G4s, thus strengthening our results. Furthermore, to understand how these candidates contribute to G4 mediated regulatory processes, we have selected and characterized two proteins (GBP2 and DNAJ) to perform functional studies following validation of their binding properties. These proteins are shown to play an important role in Plasmodium biology. In this study, we have found that the GBP2 is a dispensable protein that interacts with the selected G4. Even though the deletion of the gene is not lethal to the parasites, it still affects the expression of var genes. Whereas putative DNAJ is an essential protein and its deletion results into the arrest of the parasites at the late stages of erythrocytic cycle. Collectively, this study sheds light on this understudied DNA structure based regulatory mechanism and provide the first systematic survey of the G4 interactome. Given their essential role in parasite development further characterization of obtained candidates will likely generate new targets for antimalarial drugs that will in the long term contribute to the eradication of the disease.