La reconnaissance de l'ubiquitine et de la diubiquitine Lysine 63 par la protéine STAM2 : l'effet de la longueur et de la flexibilité des linkers

Molecular recognition of ubiquitin and Lysine 63 linked diubiquitin by STAM2 : the effect of the linkers length and flexibility

• Auteur / Autrice : Minh-Ha Nguyen Thi
• Direction : Olivier Walker, Maggy Hologne
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Résonance magnétique nucléaire
• Date : Soutenance le 04/12/2019
• Etablissement(s) : Lyon
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale de Chimie (Lyon ; 2004-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Université Claude Bernard (Lyon ; 1971-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut des Sciences Analytiques
• Jury : Président / Présidente : Bernhard Brutscher
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Olivier Walker, Maggy Hologne, Frank Gabel, Adriana-Erica Miele
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Christina Sizun, Christian Griesinger

Mots clés

Mots clés contrôlés

Rayons X -- Diffusion

Ubiquitine

Résonance magnétique nucléaire

Mots clés libres

Résonance Magnétique Nucléaire

Protéine multi-domaine

Linker

STAM2

Ubiquitine

Flexibilité

Diffusion de rayon X à petite angle

Diubiquitine Lysine 63

Nuclear Magnetic Resonance

Small angle X-ray Scattering

Multidomain protein

Linker

STAM2

Ubiquitin

Lysine 63 linked diubiquitin

Flexibility

Résumé

Les interactions protéine-proteine sont considérées comme un domaine de recherche important puisqu’elles contrôlent la plupart des processus cellulaires. Chez les cellules eucaryotes, les protéines multi-domaines (MDP), constituées d’au moins deux domaines, représentent plus de 70 % des protéines. Au sein d’une MDP, ces domaines peuvent être identiques ou différents et sont reliés par un segment intrinsèquement désordonné de longueur et de flexibilité variable. Ces protéines peuvent alors adopter de multiples conformations dans l’espace et interagir de manière spécifique avec leurs partenaires biologiques. Malgré de nombreux efforts de recherche dans le domaine, certaines questions restent encore non résolues ou nécessitent une étude approfondie. Mon projet de recherche est d’étudier et de définir le rôle des segments intrinsèquement désordonnés de la protéine STAM2 (Signal transducing adapter molecule 2) impliquée dans la machinerie ESCRT (Endosomal Sorting Complexe Required for Transport) , première étape dans le processus de dégradation lysosomale. Plus précisément, l’étude se focalise sur les effets de la flexibilité et la dynamique de ces segments dans le cas du processus de reconnaissance moléculaire entre STAM2 et l’ubiquitine ou di-ubiquitine. Différents mutants ont alors été conçus : soit avec un domaine totalement ou partiellement supprimé, soit avec un raccourcissement ou une suppression complète du segment ou soit avec de multiples mutations dans la séquence peptidique du segment. Ces différents construits ont été analysés en utilisant une combinaison de techniques biophysiques telles que la relaxation de spin par résonance magnétique nucléaire (RMN), la diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS) et le dichroïsme circulaire (CD). Il a alors été démontré qu’une altération du segment désordonné peut entraîner un changement de la dynamique de la protéine et/ou un changement conformationnel. La modification de ce segment influe sur le mouvement inter-domaine et modifie l’affinité entre les construits de STAM2 et la di-ubiquitine sans modifier l’intégrité de chaque domaine et de leur site de liaison. En résumé, les segments intrinsèquement désordonnés procurent une certaine plasticité à la protéine ce qui lui permet de s’adapter et de remplir sa fonction biologique. Il est alors possible d’imaginer dans un futur proche que ces segments soient la nouvelle génération de cibles thérapeutiques pouvant réduire ou supprimer certaines interactions nocives

Protein-protein interaction is considered as an important field of research, as it is the key to control variable cell processes and pathways. In eucaryotic cells, multidomain proteins (MDPs), which consist of more than one domain, take up over 70 % of the pool. Those identical or different domains of a MDP are connected to each other by a linker of variable length and flexibility. For long flexible linker, it allows the protein to sample a wide range of conformation and to adjust interaction in a subtle way. Despite numerous efforts of research on the field, some issues remain unanswered or require further investigation. As part of this thesis, my work aims to define the role taken by the intrinsically disordered linker within MDPs. For that purpose, the STAM2 (Signal transducing adapter molecule 2) protein of the ESCRT (Endosomal Sorting Complexes Required for Transport) machinery was chosen to examine the effect of the flexibility and dynamics of the linker regions on the molecular recognition with ubiquitin and Lysine63-linked di-ubiquitin (K63-Ub2). Such efforts were carried out by designing specific mutants altering the linker regions in different ways. The various truncated versions undergo half or complete deletion of a domain or have their linker either shortened, deleted or modified in the amino acid composition. With a combination of the several biophysical methods namely NMR (Nuclear Magnetic Resonance) spin relaxation, SAXS (Small Angle X-ray Scattering) and CD (Circular Dichroism), the study has demonstrated that the alteration in the linker region modifies the flexibility and the dynamics of the protein, one among them possibly introduces slight change in conformation. Furthermore, the modification of the linker has an impact on the inter-domain motion and alter binding affinities between STAM2 constructs and di-ubiquitin without affecting domains integrity or binding sites. In brief, disordered linkers provide plasticity to the protein, which allow adaptability and specificity to molecular recognition process. As a further application, the linkers included in multidomain proteins could also be the next generation of druggable target as their modification may reduce or completely abolish interactions