Séquençage et PCR à haut débit : application à la détection et la caractérisation d'agents pathogènes respiratoires aviaires et au contrôle de pureté microbiologique des vaccins

Next generation sequencing and high-throughput sequencing : Application to detection and characterization of avian respiratory pathogens and to the control of vaccine purity

• Auteur / Autrice : Guillaume Croville
• Direction : Thierry Dupressoir, Jean-Luc Guérin
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire et moléculaire et sciences de la santé
• Date : Soutenance le 30/10/2017
• Etablissement(s) : Paris Sciences et Lettres (ComUE)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale de l'École pratique des hautes études (Paris)
• Partenaire(s) de recherche : Établissement de préparation de la thèse : École pratique des hautes études (Paris ; 1868-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Diversité, génomes et interactions microorganismes-insectes (Montpellier)
• Jury : Président / Présidente : Jacques Izopet
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Thierry Dupressoir, Jean-Luc Guérin, Jacques Izopet, Thérèse Commes-Maerten, Étienne Thiry
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Thérèse Commes-Maerten, Étienne Thiry

Mots clés

Mots clés contrôlés

Séquençage à haut débit

Virologie

Mots clés libres

Ngs

Maladie aviaire

Vaccin

Diagnostic

Virologie

Séquençage à haut débit

Ngs

Avian disease

Vaccine

Diagnostics

Virology

High-Throughput PCR

Résumé

La capacité de détection des agents pathogènes est un enjeu croissant tant les maladies infectieuses représentent un risque pour la santé animale et humaine. La globalisation des échanges commerciaux et des voyages, l’évolution des pratiques agricoles, les changements climatiques ou encore les migrations de masse sont autant de facteurs bouleversant la biologie des micro-organismes et de fait, leurs capacités d’émergence. Ce manuscrit décrit trois approches complémentaires, basées sur trois techniques innovantes de biologie moléculaire pour la détection d’agents pathogènes et appliquées à trois contextes différents : (i) la recherche d’une liste précise de micro-organismes par PCR quantitative en temps réel en format microfluidique, (ii) la détection sans a priori d’agents infectieux dans un milieu complexe par métagénomique et séquençage Illumina (Miseq) et (iii) le génotypage d’un agent infectieux sans amplification préalable des génomes par NGS (Nouvelles Générations de séquençage) de troisième génération, le MinION d’Oxford Nanopore Technologies. Ces trois études ont permis de montrer l’apport de ces techniques, qui présentent toutes des caractéristiques distinctes, adaptées à différentes applications. Au-delà de l’application de ces techniques au domaine du diagnostic microbiologique, leur utilisation dans le cadre du contrôle des médicaments immunologiques vétérinaires est une perspective prioritaire de ce travail. En effet, les préparations vaccinales vétérinaires sont soumises à l’obligation de recherche d’une liste d’agents pathogènes à exclure mais également à la vérification de l’identité génétique des souches vaccinales. L’accessibilité et les performances exponentielles des nouvelles technologies de PCR et de séquençage ouvrent ainsi des perspectives révolutionnaires dans le domaine du diagnostic et du contrôle microbiologique.

Detection of pathogens becomes an increasing challenge, since infectious diseases represent major risks for both human and animal health. Globalization of trade and travels, evolution of farming practices and global climatic changes, as well as mass migrations are impacting the biology of pathogens and their emerging potential. This manuscript describes three approaches, based on three innovative technologies of molecular biology applied to the detection of pathogens in three different settings : (i) detection of a list of pathogens using real-time quantitative PCR on a microfluidic platform, (ii) unbiased detection of pathogens in complex matrix, using metagenomics and Illumina (Miseq) sequencing and (iii) genotyping of pathogens without isolation of PCR-enrichment using a 3rd generation NGS (Next Generation Sequencing) platform MinION from Oxford Nanopore Technologies. The three studies shown the contribution of these techniques, each representing distinctive features, suitable for the respective applications. Beyond application of these techniques to the field of microbial diagnostics, their use for the control of veterinary immunological drugs is a priority of this project. Veterinary vaccines are not only submitted to mandatory detection of listed pathogens to be excluded, but also to validation of the genetic identity of vaccine strains. The exponential availability and performances of new PCR or sequencing technologies open cutting-edge perspectives in the field of microbial diagnostic and control.