Génération de vecteurs codant pour les anticorps humains, analyse de l’expression et transgénèse chez la souris

Generation of transgenic vectors encoding human immunoglobulins, functionality assays and transgenesis in mice

• Auteur / Autrice : Aurore Villemin
• Direction : Etienne Weiss
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
• Date : Soutenance le 20/05/2014
• Etablissement(s) : Strasbourg
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Strasbourg ; 2000-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Biotechnologie et signalisation cellulaire (Strasbourg ; 2011-....)
• Jury : Président / Présidente : Sylvie Fournel
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : André Traunecker, Elisabetta Traggiai
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Jean-Louis Boulay, Michael Reth

Mots clés

Mots clés contrôlés

Souris transgéniques

Dissertations universitaires

Anticorps monoclonaux humanisés

Anticorps recombinés

Emploi en thérapeutique

Anticorps monoclonaux

Mots clés libres

Anticorps thérapeutiques

Souris transgénique humanisée

Loci d’anticorps

Souris HC KO

Transgènes humains

Cellules 300-19

Réarrangement VDJ

Diversité combinatoire

Diversité jonctionnelle

Expression d’immunoglobuline

Therapeutic antibodies

Humanized transgenic mice

Antibody loci

HC KO mice

Human transgenes

300-19 cells

VDJ rearrangement

Recombinatory diversity

Junctional diversity

Immunoglobulin expression

Résumé

Dans le but de générer une souris transgénique produisant des anticorps humains, les trois loci humains (HC, LCκ et LCλ) ont été reconstitués sous forme de YAC circulaires. Puis, pour simplifier la manipulation des gènes codant pour la chaîne lourde, quatre vecteurs plasmidiques qui résument l’information génétique contenue dans le locus humain de la chaîne lourde ont été réalisés. La construction HC Minilocus (78 kbp) est donc composée des 13 segments V sélectionnés, de la région D-J synthétisée et des gènes codant pour les parties constantes de type μ, ɣ3 et ɣ1. Trois autres constructions (~22 kbp) ont été dérivées des étapes intermédiaires de clonage. Elles sont basées sur 7 segments V et la région D-J synthétisée. Le HC Microlocus Classic (22 kb) a été obtenu après clonage du gène codant pour la partie constante ɣ1 en 3’ des éléments V, D et J précédemment cités; cette construction code pour des chaînes lourdes d’IgG1 (ɣ1 HC). De la même façon, le HC Microlocus Light (21.5 kb) contient le gène codant pour ɣ1 CH1-, cette construction code donc pour des chaînes lourdes IgG sans domaine CH1 (ɣ1 HC CH1-). Les chaînes lourdes de ce type sont exprimées sans être associées à des chaînes légères, à l’image de ce qui est observé chez les camélidés (Heavy Chain only antibodies). Enfin le HC Microlocus Light shRNA (22 kbp) est une construction basée sur le Microlocus Light à laquelle a été ajoutée une séquence codant pour quatre shRNA (small hairpin RNA) visant à réprimer l’expression d’IgM murin. Ce locus est destiné à être injecté dans des souris natives (wilde type, WT). La fonctionnalité de ces quatre vecteurs a été évaluée par transfection dans la lignée cellulaire 300-19, des lymphocytes pro B d’origine murine pouvant progresser du stade pro B au stade de cellule B mature, lorsqu’elles sont maintenues en culture. Pour les quatre constructions, plusieurs réarrangements DJ et VDJ ont été identifiés, montrant une grande diversité combinatoire et jonctionelle. Par cytométrie en flux (FACS), des chaînes lourdes humaines ont été identifiées dans le cytoplasme et à la surface des cellules transfectées avec les trois constructions intermédiaires. Les cellules exprimant des chaînes lourdes en surface ont été enrichies par FACS. Par la suite, en utilisant des méthodes immuno-enzymatiques (ELISA et ELISPOT), il a été prouvé que les chaines lourdes d’anticorps humains étaient secrétées dans le milieu extracellulaire. La transgénèse avec les constructions HC Microlocus Light et HC Microlocus Light shRNA s’est révélée efficace puisque nous avons obtenu plusieurs animaux transgéniques. Aucune cellule B n’a été détectée dans les souris HC Microlocus Light (background HC KO); alors que cette même construction associée à un shRNA (HC Microlocus Light shRNA) dans une souris transgénique au système immunitaire humoral intact, montre l’expression de chaînes lourdes d’anticorps humains dans le cytoplasme et à la surface des cellules B. La chaine lourde humaine est exprimée en parallèle des immunoglobulines endogènes à la surface des cellules pre-B, ainsi que dans les cellules B immatures et matures.

In order to generate a transgenic mouse producing human antibodies, three human loci (HC, LCκ et LCλ) were reconstituted in the form of circular YAC. Then, to simplify the manipulation of genes encoding the heavy chain, four vectors summarizing the genetic information contained in the human heavy chain locus were designed and cloned. The HC Minilocus (78 kbp) is composed of 13 V segments, a synthetic DJ cluster and the genes encoding the constant parts Cμ, Cɣ3 and Cɣ1. Three other constructions (~22 kbp) were derived from the intermediate cloning steps. They are based on 7 V segments and a DJ region synthesized. The HC Microlocus Classic (22 kbp) was obtained after cloning of the gene encoding the constant part ɣ1 in 3' of the V , D and J elements mentioned above; this construct encodes the heavy chain of IgG1 (ɣ1 HC). The HC Microlocus Light (21.5 kb) contains the gene encoding ɣ1 CH1-, therefore, this construction encodes IgG1 HC without CH1 domain (ɣ1HC CH1-). Such HC are expressed without being associated with light chain (Heavy Chain only antibodies). Finally, the HC Microlocus Light shRNA (22 kb) is based on the HC Microlocus Light to which was added a sequence encoding four shRNA (small hairpin RNA) to repress the murine IgM expression. This locus is designed to be injected into wild type mouse. The functionality of the four reduced human HC constructs was assessed in mouse cells. The 300-19 cell line was used because is a pro-B cell line able to rearrange endogenous or transgenic Ig genes and to express the rearranged genes as Ig proteins. 300-19 cells were transduced with the four reduced human HC constructs and the expression of the transgenic Ig genes was investigated in detail. Indeed, DJ and VDJ rearrangement, recombinatory diversity, junctional diversity, transcription, mRNA maturation, alternative splicing, Ig surface expression and secretion were assessed. The data demonstrated that these constructs undergo editing and processing in murine cells and give rise to a large diversity of human heavy chains. The HC Microlocus Light was injected in HC knock out mouse oocytes and the HC Microlocus Light shRNA (which is exactly identical to the Microlocus Light concerning the antibody gene part) in wild type mouse oocytes. Injection in wild type mice led to human γ1 HC expression, whereas injections in HC KO mice did not show any B cell population reconstitution and consequently no human HC γ1 expression. Transgenic human ɣ1 HC and endogenous mouse IgM are co-expressed at the surface of progenitor-, immature- and mature B cells.