Serology by microarrays of infections caused by fastidious bacteria

Sérologie par micropuces des infections à bactéries fastidieuses

• Auteur / Autrice : Cyrille Bonhomme
• Direction : Didier Raoult
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Pathologie humaine. Maladies transmissibles et pathologies tropicales
• Date : Soutenance en 2008
• Etablissement(s) : Aix-Marseille 2
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Unité de recherche sur les maladies infectieuses et tropicales émergentes (Marseille)
• Partenaire(s) de recherche : autre partenaire : Université d'Aix-Marseille II. Faculté de médecine (1970-2011)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Immunofluorescence

Diagnostic

Maladie de Whipple

Sérologie

Procédures d'analyse sur micropuce

Cultures cellulaires

Microorganismes pathogènes intracellulaires

Résumé

L’objectif de cette thèse a été d’optimiser la sérologie des bactéries difficilement cultivables en utilisant la technologie des micropuces. Deux modèles ont fait l’objet de nos recherches, les bactéries du genre Bartonella et T. Whipplei. En utilisant des micropuces fabriquées par dépôt de bactéries intactes couplées à la détection du signal par immunofluorescence nous avons confirmé que cette technologie était un outil simple, rapide et performant à la fois pour l’identification et le sérotypage des souches bactériennes et le criblage d’anticorps monoclonaux. Dans une seconde approche, dont la finalité était la recherche de marqueurs antigéniques pour le diagnostic de la maladie de Whipple, nous avons développé des micropuces comportant outre les bactéries entières, des protéines purifiées et des protéines recombinantes spécifiques de T. Whipplei. Les candidats clonés et exprimés ont été sélectionnés par rapport à leur potentiel antigénique par analyse bio-informatique mais aussi en fonction de résultats d’immunoprotéomique et des données de la littérature. Leur reconnaissance par des sérums de lapins immunisés a permis de confirmer que 19 d’entre elles étaient immunoréactives. Nous avons cependant constaté que la réponse humorale classique (IgG) des porteurs asymptomatiques était plus forte que celle des patients atteints de la maladie de Whipple. En revanche, la réaction des IgA vis-à-vis de ces mêmes antigènes, a tendance à être prépondérante chez les malades. Ces données nous ont conduits à évaluer le rôle des modifications post-traductionnelles, et en particulier de la glycosylation, dans la réponse antigénique. Nous avons établi la présence de glycoprotéines chez T. Whipplei, la protéine TWT 608 de la famille des WiSP (protéines membranaires contenant des motifs répétés) étant la protéine principalement glycosylée. Nous avons également observé la disparition du profil de glycosylation lors des sous-cultures en milieu axénique. Des analyses d’immunofluorescence et de microscopie électronique ont indiqué que ces glycoprotéines étaient sécrétées. Dans les macrophages infectés de biopsies duodénales humaines nous avons observé une co-localisation entre la glycoprotéine majoritaire (GpTw110) et la coloration à l’acide périodique de Schiff. De fait, la sécrétion de cette glycoprotéine participe à la formation d’un biofilm qui s’accroît lors de la culture cellulaire. En ce qui concerne le rôle de cette glycoprotéine dans la réponse de l’hôte, nous avons constaté que parmi les personnes infectées par T. Whipplei, les patients avaient une réponse sérologique déficiente par rapport aux porteurs asymptomatiques. Cette réponse est principalement dirigée contre les glycoprotéines et disparaît au cours de la culture in vitro. Notre hypothèse est que le biofilm, composé en partie de glycoprotéines sécrétées, empêche l'immuno-réaction et protége T. Whipplei chez les patients. En conclusion, ce travail de thèse confirme que l’approche micropuces à protéines est un outil puissant pour la recherche d’antigènes et pour la compréhension des mécanismes de pathogénicité des bactéries difficiles à cultiver.

The aim of this thesis was to improve the serology of fastidious bacteria by using the protein microarray technology. Two models were used in this work, the bacteria from the Bartonella genus and T. Whipplei. By using microarray slides constructed with intact bacteria coupled with the detection of bound antibodies by immunofluorescence, we confirmed that this technology was an easy, fast and powerful tool for the identification and the serotyping of different bacteria as well as for the screening of monoclonal antibodies. In a second step, aimed at identifying putative antigenic markers for the diagnosis of Whipple disease, we developed microarrays containing not only the whole bacteria but also purified and recombinant T. Whipplei proteins. The proteins cloned and expressed were selected by bioinformatic analyses, from immunoproteomic results and from published data. Their recognition by sera of immunized rabbits confirmed that 19 candidates were endowed for antigenic properties. We therefore observed that the classical immune response (IgG) of the asymptomatic carriers was stronger than that of the infected patients. In contrast, the reaction of IgA from infected patients against the same antigens was higher than that of carriers. These results led us to evaluate the role of post-transcriptional modifications, and most particularly of glycosylations in the antigenic response. We thus established the presence of glycoproteins within T. Whipplei, the protein TWT 608 from the WiSP family of membrane proteins being the major glycosylated one. We also noticed the disappearance of glycosylation profile during subculture in axenic medium. Immunofluorescence and electronic microscopy studies indicated that these glycoproteins were secreted. In infected macrophages from human duodenal biopsies a co-localization was evidenced between the major glycoprotein and staining by the periodic acid of Schiff. Accordingly, glycoprotein secretion should take place in the formation of a biofilm. Finally, we analyzed the role of this glycoprotein in the host response upon infection. Among infected people, the patients exhibited a lower serologic response mainly focused against the glycoproteins which disappeared in the in vitro culture. We thus hypothesized that the biofilm of glycoproteins should prevent the immunoreaction and protect T whipplei against patients. Overall, the work achieved during this thesis confirmed that the protein microarray approach is a powerful tool for the search of antigens and the comprehension of the pathogenic mechanisms of fastidious bacteria.