Modélisation et compréhension de la glycogénose de type III grâce à l'utilisation de cellules souches pluripotentes induites humaines

Modeling and understanding glycogen storage disease type III using human induced pluripotent stem cells

• Auteur / Autrice : Lucille Rossiaud
• Direction : Xavier Nissan, Lucile Hoch
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie moléculaire et cellulaire
• Date : Soutenance le 03/12/2024
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Structure et Dynamique des Systèmes Vivants
• Partenaire(s) de recherche : Référent : Université d'Évry Val d'Essonne
• Partenaire(s) de recherche : graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Life Sciences and Health (2020-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut des Cellules Souches pour le Traitement et l’Etude des maladies Monogéniques (Evry, Essonne)
• Jury : Président / Présidente : Elisabeth Petit-Teixeira
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Frédéric Relaix, Alicia Mayeuf, Fabienne Rajas, Pascal Laforêt, Sacha Reichman
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Frédéric Relaix, Alicia Mayeuf

Mots clés

Mots clés contrôlés

Marqueurs biologiques

Cellules souches pluripotentes induites

Thérapie génique

Glycogénose de type III

Mots clés libres

Glycogénose de type III

Cellules souches pluripotentes induites humaines

Modélisation pathologique

Biomarqueur

Thérapie génique

Glycogen storage disease type III

Human induced pluripotent stem cells

Pathological modeling

Biomarker

Gene therapy

Résumé

La glycogénose de type III (GSDIII) est une maladie génétique rare due à un déficit en enzyme débranchante du glycogène (GDE), provoquant une accumulation de glycogène dans le foie, le cœur et les muscles squelettiques. Alors que les atteintes hépatiques dominent durant l'enfance, les atteintes musculaires progressent et deviennent prédominantes à l'âge adulte. L'absence de modèles humains freine la compréhension de cette pathologie et la mise au point de traitements.Dans ce contexte, mon premier objectif était de créer des modèles pathologiques humains in vitro à partir de cellules souches pluripotentes induites (hiPSC). J'ai généré cinq lignées hiPSC pathologiques : quatre lignées dérivées de patients par reprogrammation et une lignée génétiquement modifiée par CRISPR/Cas9. Ces cellules ont ensuite été différenciées en myocytes et en hépatocytes, les deux types cellulaires pertinents pour l'étude de la GSDIII. J'ai confirmé que ces cellules expriment respectivement les marqueurs spécifiques des muscles et du foie, et récapitulent, en condition de privation de glucose, le phénotype d'accumulation de glycogène en comparaison à des cellules saines.Le deuxième objectif visait à mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques de la GSDIII et à identifier de nouveaux biomarqueurs de la pathologie. Je me suis d'abord focalisée sur le muscle, pour lequel j'ai identifié, par séquençage ARN des myocytes dérivés d'hiPSC, des gènes différentiellement exprimés entre cellules saines et pathologiques. Une analyse comparative avec les données d'un séquençage ARN réalisés sur des biopsies de triceps de souris saines et GSDIII a révélé la surexpression d'un gène commun codant pour la Galectine-3, un marqueur de vésicules endommagées. Sa surexpression a été validée dans les myocytes mutés dérivés d'hiPSC, ainsi que dans les triceps de souris GSDIII et dans des biopsies de patients. En parallèle, une approche similaire sur les hépatocytes dérivés d'hiPSC a permis d'identifier de potentiels biomarqueurs du foie, ouvrant la voie à une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques hépatiques. Le dernier objectif était d'utiliser ces modèles pathologiques humains in vitro pour tester de nouvelles thérapies. J'ai démontré que le traitement de myocytes mutés par des vecteurs AAV exprimant la GDE humaine complète ou tronquée, préalablement validés dans des modèles in vivo de souris et de rats GSDIII, diminuait l'accumulation de glycogène à des niveaux comparables à ceux de cellules saines. Ces expériences ont confirmé l'intérêt du développement de ces nouveaux modèles in vitro. L'ensemble de ces travaux ont permis l'identification de nouveaux biomarqueurs de la GSDIII, permettant d'améliorer la compréhension des mécanismes moléculaires dans le muscle et le foie. La création de ces nouveaux modèles in vitro ouvre également de nouvelles perspectives thérapeutiques pour la GSDIII, notamment en facilitant le criblage de médicaments.

Glycogen storage disease type III (GSDIII) is a rare genetic disorder caused by glycogen debranching enzyme (GDE) deficiency, leading to an accumulation of glycogen accumulation in the liver, heart and skeletal muscles. While liver damages predominate in childhood, muscle impairments progress and become predominant in adulthood. The lack of human models hinders our understanding of the disease and the development of treatments.In this context, my first objective was to create in vitro human pathological models from induced pluripotent stem cells (hiPSCs). I generated five pathological hiPSC lines: four lines derived from patients by reprogramming and one line genetically modified by CRISPR/Cas9. These cells were then differentiated into myocytes and hepatocytes, the two relevant cell types for the study of GSDIII. I confirmed that these cells express muscle and liver specific markers respectively, and recapitulate the glycogen accumulation phenotype under glucose starvation conditions compared to healthy cells.The second objective was to better understand the pathophysiological mechanisms of GSDIII and to identify new biomarkers of the disease. I first focused on muscle, for which I identified genes differentially expressed between healthy and pathological cells by RNA sequencing of hiPSC-derived myocytes. Comparative analysis with RNA sequencing data from triceps biopsies of healthy and GSDIII mice revealed overexpression of a common gene encoding galectin-3, a marker of damaged vesicles. This overexpression was validated in mutated myocytes derived from hiPSCs, as well as in the triceps of GSDIII mice and in patient biopsies. In parallel, a similar approach on hiPSC-derived hepatocytes identified potential liver biomarkers, paving the way for a better understanding of the mechanisms of liver damage.The final objective was to use these in vitro human pathological models to test new therapies. I demonstrated that treatment of mutated myocytes with AAV vectors expressing complete or truncated human GDE, previously validated on in vivo GSDIII mouse and rat models, reduced glycogen accumulation to levels comparable to those of healthy cells. These experiments confirmed the value of developing these new in vitro models.Taken together, this work has led to the identification of new biomarkers for GSDIII, providing a better understanding of the molecular mechanisms in muscle and liver. The creation of these new in vitro models also opens up new therapeutic prospects for GSDIII, particularly by facilitating drug screening.