Ingénierie moléculaire de la réactivité croisée inter-espèces d’anticorps thérapeutiques par Yeast Surface Display

Molecular engineering of cross-species reactivity of antibodies using Yeast Surface Display

• Auteur / Autrice : Tiphanie Pruvost
• Direction : Bernard Maillère
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Immunologie
• Date : Soutenance le 22/12/2023
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Innovation thérapeutique : du fondamental à l'appliqué (Châtenay-Malabry, Hauts-de-Seine ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Médicaments et technologies pour la santé (Gif-sur-Yvette, Essonne ; 2020-....)
• Partenaire(s) de recherche : Référent : Faculté de pharmacie
• Partenaire(s) de recherche : graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Life Sciences and Health (2020-….)
• Jury : Président / Présidente : Agathe Urvoas
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Frédéric Pecorari, Marie-Alix Poul, Thomas Bouquin
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Frédéric Pecorari, Marie-Alix Poul

Mots clés

Mots clés contrôlés

Anticorps

Mots clés libres

Réactivité croisée inter-espèces

Ingénierie des protéines

Expression à la surface de la levure

Cross-species reactivity

Protein engineering

Yeast Surface Display

Résumé

Le succès des anticorps monoclonaux comme outils thérapeutiques s'explique en partie par leur grande spécificité pour leur cible. Celle-ci implique souvent qu'un anticorps développé contre une cible humaine échoue à la reconnaître chez les espèces utilisées lors des essais précliniques. L'objectif de ces travaux est de développer une méthode d'ingénierie de protéine permettant à un anticorps de reconnaître un antigène provenant d'espèces différentes en utilisant comme modèles deux anticorps reconnaissant la protéine LAMP1 humaine mais pas ses versions murine et simienne. Durant ce projet le principe de mutagénèse exhaustive à l'acide aminé près (DMS) est couplé à l'expression de protéines à la surface des levures (YSD) ainsi qu'à la cytométrie en flux. Une première partie détaille l'utilisation de la combinaison de ces techniques pour l'identification des épitopes des deux anticorps sur LAMP1 humain. Les acides aminés situés dans les épitopes ont alors pu être comparés à ceux des protéines murine et simienne ce qui a permis d'expliquer l'absence de reconnaissance pour ces deux protéines. La seconde partie décrit la stratégie d'ingénierie protéique développée sur ces deux anticorps. L'expression des banques de DMS à la surface des levures a permis de sélectionner des mutations améliorant la reconnaissance croisée de LAMP1 sans affecter la fonctionnalité de l'anticorps. Ces mutations ont alors été combinées dans une nouvelle banque qui a été à nouveau criblée à plusieurs reprises pour en extraire les variants les plus promoteurs. L'affinité de ces variants pour différents orthologues de LAMP1 a pu être évaluée afin de confirmer l'efficacité de la stratégie grâce à laquelle plusieurs variants cross-réactifs ont pu être obtenus pour les deux anticorps étudiés.

Success of the monoclonal antibodies as therapeutic tools is partly due to their high specificity for their targets. Because of this high specificity antibodies developed against a human target often fail to recognize this target in animals used as models in preclinical trials. Thus, the goal of this study is to develop a protein engineering method aiming at conferring an antibody the ability to recognize a same antigen belonging to different species. To do so, two antibodies recognizing the human LAMP1 protein but not the murine and simian LAMP1 are used as models. In this project an exhaustive mutagenesis (DMS) monitored by Yeast Surface Display (YSD) and flow cytometry. The first part describes how these technics are combined in order to identify the epitopes of two antibodies on human LAMP1. The amino acids of epitopes are compared to those of murine and simian LAMP1 to explain the lack of recongnition of this two proteins. The second part focuses on the engineering strategy developped on the two antibodies. The expression of the DMS libraries in YSD allowed to select single mutations improving the cross-reactivity on LMAP1 without affecting the functionality of the antibodies. These mutations have been combined in a second library that has been screened for promissing variants. The affinities of these variants for differents human et simian LAMP1 orthologs has been measured to confirm the succes of the strategy. For each antibody many cross-reactive variants have been obtained.