Habilitation et optimisation des systèmes cell-free pour les applications de biologie synthétique

Enabling and optimizing cell-free systems for synthetic biology applications

• Auteur / Autrice : Angelo Cardoso Batista
• Direction : Jean-Loup Faulon, Manish Kushwaha
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
• Date : Soutenance le 18/05/2022
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Structure et Dynamique des Systèmes Vivants
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Microbiologie de l'Alimentation au Service de la Santé humaine (Jouy-en-Josas)
• Partenaire(s) de recherche : référent : Faculté des sciences d'Orsay
• Partenaire(s) de recherche : graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Life Sciences and Health (2020-....)
• Jury : Président / Présidente : Grégory Lavieu
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Nadanai Laohakunakorn, Baptiste Panthu, Chase Beisel, Rodrigo Ledesma Amaro
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Nadanai Laohakunakorn, Baptiste Panthu

Mots clés

Mots clés contrôlés

Systèmes acellulaires

Biologie moléculaire

Biologie de synthèse

Biocapteurs

Ingénierie métabolique

Mots clés libres

Systèmes cell-free

Génie métabolique

ADN linéaire

Biosenseurs

Optimisation de tampon

Cell-free systems

Metabolic engineering

Linear DNA

Biosensing

Buffer optimization

Résumé

L'objectif de cette thèse est de couvrir trois facettes de la recherche sur les technologies cell-free, à savoir : i. l'utilisation de la technologie cell-free à des fins d'ingénierie métabolique, ii. les procédés de stabilisation d'ADN linéaire dans un environnement cell-free et iii. l'optimisation de l'expression des protéines dans les systèmes cell-free. La section I présente la tentative de biosynthèse de deux métabolites végétaux d'intérêt industriel, la Pinocembrine et le Sinapoyl-Malate. Pour évaluer le prototypage de l'ingénierie des voies, la quantification de ces molécules pourrait être vérifiée par biodétection. Dans cette thèse, une Pinocembrine validée en laboratoire in vivo a été testée ainsi que 3 nouveaux biocapteurs différents pour le Sinapoyl-Malate. Dans la section II, l'utilisation de l'ADN linéaire pourrait potentiellement accélérer le prototypage des nouvelles constructions génétiques, indépendamment des étapes de clonage. Pour cela 2 stratégies ont été mises en place pour stabiliser l'ADN : à partir de la circularisation in vitro de l'ADN linéaire en dumbbell-DNA ou en concatémères circulaires.De plus, des souches d'E. coli ont été génétiquement modifiées pour créer lysats des mutants d'exonucléase d'ADN linéaire, ∆recB et ∆recBCD . Une fois que le tampon a été caractérisé individuellement pour le type d'ADN, l'ADN linéaire montre une expression comparable à l'ADN plasmidique. La section III aborde l'optimisation de la synthèse des protéines en utilisant des séquences de ribozymes pour circulariser et par conséquent prolonger le turnover des produits de mARN. Une fois que le mARN circulaire est plus résistant aux nucléases, l'expression des protéines est augmentée. De plus, la composition du tampon d'expression en cell-free a été méticuleusement améliorée pour le rendement global en protéines grâce à une approche d'Active Learning. Cette amélioration a conduit à une réduction considérable des variations de type batch-to-batch. Globalement, cette thèse démontre l'ingéniosité de l'amélioration des systèmes cell-free et ses différentes applications potentielles en biologie synthétique.

The aim of the thesis covers three facets of cell-free technology research, i. the use of the cell-free technology for metabolic engineering purposes, ii. methods for stabilizing linear DNA in a cell-free environment and iii. the optimization of protein expression in cell-free systems. The section I showcases the attempt of biosynthesis of two plant metabolites Pinocembrin and Sinapoyl-Malate with industrial interest. To assess the pathway engineering implementation in a high-throughput cycle, the quantification of these molecules could be verified by biosensing. In the thesis, a lab in vivo validated Pinocembrin was tested as well as 3 different new biosensors for Sinapoyl-Malate. In section II, the use of linear DNA could potentially speed-up allowing a rapid screening of genetic constructs regardless of cloning steps. For that 2 strategies were implemented to stabilize DNA by circularizing linear DNA intodbDNA or circular concatemers. In addition, E. coli strains were genetically modified for creating exonuclease mutants ∆recB and ∆recBCD lysates. Once, buffer is individually characterized for DNA type, linear DNA shows comparable expression to plasmid DNA. Section III approaches the optimization of protein synthesis by using ribozyme sequences to circularize and consequently prolong mRNA products turnover. Once mRNA is more resistant to nucleases, protein expression is augmented. Additionally, buffer composition was meticulously improved for overall protein yield with an Active Machine Learning approach. This improvement led to a considerable reduction of batch-to-batch variations. Overall, the thesis demonstrates the contrivance of improving cell-free systems and its different potential applications in synthetic biology.