Optimization and automation of 3D bio-imaging tools to characterize nuclear morphology and chromatin organization
Optimisation et automatisation d'outils de bio-imagerie 3D pour caractériser la morphologie nucléaire et l'organisation de la chromatine
Résumé
The nucleus is a compartmentalized organelle of the eukaryotic cells with a dynamic morphology and containing distinct chromosomal domains and nuclear bodies. To link nuclear structure and function, we have developed a simple and user-friendly ImageJ plugin called NucleusJ to quantify in 3D the nuclear morphology as well as positioning and organization of nuclear domains. From confocal images, the workflow applies for a batch of images a modified Otsu thresholding method to segment the nuclear space and a 3D watershed algorithm to delimit chromatin domains by partitioning the nucleus. Quantitative parameters are computed including shape and size of nuclei as well as intra-nuclear objects such as chromatin domains and their position in respect to the nuclear periphery [Poulet et al., 2015]. New improvements have been added to NucleusJ and a new version has been released [Dubos et al., 2020]. First, the current version involves manual intervention to delimit a bounding volume including each considered nucleus. To overcome this limitation and automatically capture large numbers of nuclei at various depths in the original image, the so-called autocrop procedure has been implemented to automatically detect the nuclei from wide field images. Spatial positions of the cropped nuclei are then recorded in order to estimate distance maps as a new estimator of spatial distribution of the nuclei in a whole tissue context. Second, as the main step in our workflow is to delimit the nucleus or intra-nuclear objects from the background alternatives to the 3D watershed which cannot be fully automated have been explored. To this aim, we adapted convex hull algorithms in 3D such as the gift wrapping (Jarvis march) and the Graham scan methods based on discrete geometry and integrated into the NucleusJ workflow. Moreover, to get rid of the semi-automated step inherent to the 3D watershed step, NODeJ was developed to automatically segment high-intensity nuclear domains such as chromocenters by applying the gradient method on the mask of a nucleus to enhance the contrast of intra-nuclear objects and allow their segmentation. Finally, to improve the efficiency of our image analysis workflow and move to high-throughput image analysis, a new library called OMERO Service Client was designed in order to directly load NucleusJ on images stored in a well-organized manner within the OMERO platform while benefiting from the computing power of a remote server. These developments were collectively used in a proof-of-concept project to evaluate the relevance of nuclear morphology and chromatin organization traits computed by NucleusJ to predict the viability from human spermatozoa from large field images stored in OMERO. Finally, in a more exploratory phase, a U-Net model was trained using ground truth datasets gained from NucleusJ segmentation in order to explore new innovative methods to be implemented in the future. The developments presented in this manuscript have been designed to optimize the 3D image storage and analysis of nuclei and to move towards higher throughput analyses. Our workflow was designed with the aim to ensure a high standard of repeatability, reproducibility and accessibility. Such developments will open the way to a better description of the 3D nucleus that we hope will benefit the largest number of researcher in the field and advance our knowledge on the role of the nucleus in the regulation of gene expression.
Le noyau est un organite essentiel des cellules eucaryotes qui présente une morphologie dynamique et dont le contenu est organisé en domaines. Nous avons développé le plugin ImageJ appelé NucleusJ pour le calcul de paramètres caractérisant la forme et la taille des noyaux ainsi que les objets intra-nucléaires tels que les domaines de chromatine et leur position par rapport à la périphérie nucléaire [Poulet et al., 2015]. Une nouvelle version complètement automatisée appelée NucleusJ2.0 a été publiée [Dubos et al., 2020] comportant de nouvelles fonctionnalités et des alternatives aux étapes manuelles. Une étape dite d’autocrop a été implémentée pour capturer automatiquement un grand nombre de noyaux à différentes profondeurs dans une pile d’images grand champ. Nous avons complété la méthode de segmentation du noyau, un seuillage Otsu modifié, en adaptant des algorithmes de définition de l’enveloppe convexe en 3D tels que le gift wrapping (marche de Jarvis) et la méthode du parcours de Graham avant de les intégrer dans NucleusJ2.0. Afin de s’affranchir d’une étape semi-automatique inhérente à l’étape de ligne de partage des eaux utilisée pour décrire le contenu en chromatine, NODeJ a été développé pour segmenter automatiquement les domaines nucléaires de forte intensité en appliquant la méthode du gradient. De plus, pour améliorer l’efficacité de notre flux d’analyse d’images, une nouvelle bibliothèque appelée Simple OMERO Client a été conçue afin d’utiliser NucleusJ2.0 directement sur des images stockées au sein de la plateforme OMERO tout en bénéficiant de la puissance de calcul d’un serveur distant. Tous ces développements ont été utilisés collectivement dans un projet de preuve de concept où la structure tridimensionnelle du spermatozoı̈de est évaluée comme indicateur de sa qualité. Enfin, dans une phase plus exploratoire, un modèle U-Net a été entraı̂né à l’aide d’images segmentées par NucleusJ2.0 afin d’explorer les nouvelles méthodes innovantes de deep learning. Les développements présentés dans ce manuscrit ont été conçus pour optimiser le stockage et l’analyse d’images 3D de noyaux et pour évoluer vers des analyses à plus haut débit avec le souhait d’assurer un haut niveau de répétabilité, de reproductibilité et d’accessibilité. De tels développements ouvriront la voie à une meilleure description du noyau en 3D et, nous l’espérons, bénéficieront au plus grand nombre de chercheurs dans le domaine de l’imagerie 3D dédiée à la microscopie afin de faire progresser nos connaissances sur le rôle du noyau dans la régulation de l’expression des gènes.
Origine : Version validée par le jury (STAR)
