Développement d'un procédé de production de bactéries probiotiques extrêmement sensibles à l'oxygène

Development of a production process for extremely oxygen sensitive probiotic bacteria

• Auteur / Autrice : Audrey Raise
• Direction : Laurent Beney, Sébastien Dupont
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biotechnologies agro-alimentaires
• Date : Soutenance le 15/12/2021
• Etablissement(s) : Bourgogne Franche-Comté
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Environnements, Santé (Dijon ; Besançon ; 2012-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Procédés Alimentaires et Microbiologiques (PAM) (Dijon)
• Partenaire(s) de recherche : Etablissement de préparation : Université de Bourgogne (1970-....)
• Jury : Président / Présidente : Emmanuel Guedon
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Aurélie Rieu-Guigon, Olivier Firmesse
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Emmanuel Guedon, Jean-Marc Chatel

Mots clés

Mots clés contrôlés

Côlon

Oxygène

Probiotiques

Bactéries

Mots clés libres

Procédé de production

Faecalibacterium prausnitzii

Bactéries extrêmement sensibles à l’oxygène

Probiotiques de nouvelle génération

Milieu de culture

Encapsulation

Production process

Faecalibacterium prausnitzii

Extremely oxygen sensitive bacteria

Next generation probiotics

Culture medium

Encapsulation

Résumé

La supplémentation en bactéries commensales de l’intestin fait partie des futurs traitements les plus prometteurs pour de nombreuses maladies. Cependant, en raison de l’extrême sensibilité à l’oxygène de la plupart d’entre elles, de leurs exigences nutritionnelles et de leurs faibles résistances à de nombreux stress, il est actuellement difficile de produire ces bactéries et de les délivrer viables et fonctionnelles au côlon, leur site d’action. Les travaux réalisés dans le cadre de cette thèse avaient pour objectif de lever les principaux verrous techniques limitant leur production et leur commercialisation comme probiotiques. Quatre thématiques ont été abordées : l’étude de leur sensibilité à l’oxygène, le développement d’un milieu de culture adapté, la mise en place d’un procédé de culture en bioréacteur et la mise en forme galénique de ces bactéries. Elles ont été étudiées en utilisant comme bactérie modèle Faecalibacterium prausnitzii, l’une des bactéries commensales de l’intestin extrêmement sensibles à l’oxygène (ESO) à potentiel probiotique les plus prometteuses. Les résultats obtenus suggèrent que la survie à l’oxygène de F. prausnitzii dépend d’un ratio entre un nombre de molécules d’oxygène et un nombre de bactéries et que l’oxygène réagit avec des composés cellulaires. Ils ont également montré que cette bactérie est très sensible à l’oxygène en milieu liquide mais qu’elle est également capable de survivre et de reprendre en croissance dans un milieu préalablement oxygéné. Concernant les travaux menés sur le milieu de culture, ces derniers ont permis de formuler un milieu performant, économiquement compétitif, industrialisable, adapté à la croissance de F. prausnitzii et dépourvu de composé d’origine animale. Ce milieu, l’identification de paramètres impactant la croissance de cette bactérie (temps de pré-culture, volume d’inoculum, pH, maintien de l’anaérobiose) et l’utilisation d’un bioréacteur de paillasse conçu pour sa cu lture ont ensuite permis de mettre en place un procédé de culture adapté à cette bactérie, permettant d’atteindre des rendements en biomasse compatibles avec une utilisation industrielle. Les résultats générés ont également permis d’établir un cahier des charges pour un bioréacteur pilote adapté pour la production de cette bactérie. Finalement, les essais réalisés sur la mise en forme galénique de F. prausnitzii ont montré que cette bactérie ne peut pas être délivrée viable au côlon sans protection. Aucune des formes galéniques formulées jusqu'à présent n’a permis de stabiliser à la fois la bactérie lors du stockage et de la protéger efficacement lors de son passage dans le tube digestif. Cependant, l’une d’entre elles, les comprimés enrobés de mélange lipidique, semble prometteuse et pourrait, avec quelques améliorations, répondre à ces exigences. L’ensemble de ces travaux permet par conséquent de poser les bases d’une ligne de production adaptée à la production des bactéries ESO, notamment à F. prausnitzii, grâce aux connaissances générées et aux avancées techniques réalisées.

Supplementation with commensal gut bacteria is among the most promising future treatments for many diseases. However, due to the extreme oxygen sensitivity of most of them, their nutritional requirements and their low resistances to many stresses, it is currently difficult to produce these bacteria and deliver them viable and functional to the colon, their site of action. The work carried out in this thesis aimed at removing the main technical barriers limiting their production and marketing as probiotics. Four topics were addressed: the study of their sensitivity to oxygen, the development of a suitable culture medium, the implementation of a culture process in bioreactor and the formulation of these bacteria. These topics were studied using Faecalibacterium prausnitzii, one of the most promising extremely oxygen sensitive (EOS) gut commensal bacteria with probiotic potential, as a model bacterium. The results obtained suggest that the oxygen survival of F. prausnitzii depends on a ratio between a number of oxygen molecules and a number of bacteria and that oxygen reacts with cellular compounds. They also showed that this bacterium is very sensitive to oxygen in a liquid environment but that it is also able to survive and resume growth in a previously oxygenated environment. Concerning the work carried out on the culture medium, it allowed to formulate an efficient, economically competitive and industrializable medium, adapted to the growth of F. prausnitzii and free of compounds of animal origin. This medium, the identification of parameters impacting the growth of this bacterium (pre-culture time, inoculum volume, pH, maintenance of anaerobiosis) and the use of a small bioreactor designed for its culture have then allowed to set up a culture process adapted to this bacterium, allowing to reach biomass yields compatible with an industrial use. The results generated also allowed to establish a specification for a pilot bioreactor adapt ed for the production of this bacterium. Finally, the tests carried out on the galenic form of F. prausnitzii showed that this bacterium cannot be delivered viable to the colon without protection. None of the galenic forms formulated so far allowed to stabilize the bacterium during storage and to protect it efficiently during its passage in the digestive tract. However, tablets coated with a lipid mixture seem promising and could meet these requirements with some improvements. These works therefore enable to lay the foundations of a production line adapted to the production of EOS bacteria, particularly F. prausnitzii, thanks to the knowledge generated and the technical advances made.