Suivi en temps réel d'extraits cellulaires par RMN pour comprendre et optimiser les systèmes métaboliques : étude du contrôle exercé par les cofacteurs sur le métabolisme central d'Escherichia coli.

Real time monitoring of cell free extracts by NMR to understand and optimize metabolic systems : investigating the control exerted by cofactors in Escherichia coli central metabolism.

• Auteur / Autrice : Neil Cox
• Direction : Guy Lippens, Pierre Millard
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Ingénieries microbienne et enzymatique
• Date : Soutenance le 06/10/2021
• Etablissement(s) : Toulouse, INSA
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences écologiques, vétérinaires, agronomiques et bioingénieries (Toulouse)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : TBI - Toulouse Biotechnology Institute, Bio & Chemical Engineering - Toulouse Biotechnology Institute / TBI
• Jury : Président / Présidente : Fabien Letisse
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Guy Lippens, Pierre Millard, Sophie Colombie, Ulrich Günther, Johannes Hans Geiselmann
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Sophie Colombie, Ulrich Günther

Mots clés

Mots clés contrôlés

Résonance magnétique nucléaire

Enzymes -- Métabolisme

Phosphorylation

Mots clés libres

Phosphorylation

Metabolisme

Résonance Magnétique Nucléaire

Reseau metabolique

Metabolism

Nuclear Magnetic Resonance

Phosphorylation

Metabolic network

Résumé

La vie peut être décomposée en un ensemble de réactions chimiques catalysées par des enzymes qui composent un réseau dense et hautement connecté appelé métabolisme. Son étude est essentielle pour comprendre les processus biologiques (réponse au stress, l'adaptation...) et pour mieux les contrôler (en biotechnologie, en pharmacologie). La régulation de ce réseau est hiérarchique, les niveaux d'expression des protéines et les modifications post-traductionnelles jouant un rôle important. Les métabolites jouent également essentiel, car les réactions dépendent de la disponibilité des substrats et des produits, ainsi que des interactions longue distance ou les métabolites ont un effet régulateur sur l'activité enzymatique. L'étude de cette régulation est complexe, car le comportement des réactions isolées (des enzymes et des substrats purifiés) ne reproduit pas les aspects de régulation du réseau. L'analyse in situ, idéalement dans des cellules vivantes et en temps réel, est un défi expérimental en raison de l'échelle de temps rapide de la régulation, de la vaste gamme de concentrations de métabolites et des contraintes liées au maintien d'une suspension cellulaire dans un état métabolique stable. Enfin, le réseau métabolique à l'intérieur de la cellule étanche aux aux perturbations externes (par exemple, l'ajout d'une enzyme, d'un substrat, d'un inhibiteur...).Une réponse potentielle est l'utilisation d'extraits cellulaires actifs (CFE), obtenus par la lyse des cellules et la séparation de leurs composants solubles. Les réactions métaboliques qui se produisent dans le CFE en réponse à une perturbation peuvent ensuite être étudiées par spectrométrie de masse ou par résonance magnétique nucléaire (RMN). Cet outil est bien adapté et non destructif permet l'identification et la quantification de petites molécules organiques dans une matrice complexe, tout au long de réactions chimiques en temps réel.Le travail présenté dans cette thèse est basé sur l'hypothèse que l'étude du réseau métabolique dans les CFE en temps réel peut fournir des informations sur le fonctionnement du réseau métabolique. Nous avons d'abord adapté les méthodes d'analyse par RMN pour mesurer les paramètres physicochimiques tels que le pH simultanément à la concentration des métabolites (chapitre II). En nous concentrant sur les métabolites glycolytiques dans l'extrait, nous avons développé des séquences RMN pour l'identification spécifique des métabolites phosphorylés dans des échantillons biologiques complexes (chapitre III).En utilisant les méthodes RMN ainsi développées, nous avons d'abord caractérisé les protocoles de préparation, en termes d'activité et reproductibilité des CFE. Nous avons ensuite étudié l'activité glycolytique et la partition voie des pentoses phosphates/glycolyse dans l'EFC en fonction des pools de cofacteurs et de leur régénération. Nos résultats confirment que les cofacteurs peuvent avoir une forte influence sur le flux glycolytique, faisant écho à ce qui a été observé in vivo, mais suggèrent également d'autres hypothèses sur le rôle des cofacteurs sur le métabolisme central, validant l'utilisation de CFE pour étudier la régulation métabolique.Enfin, nous avons caractérisé deux petites protéines par RMN, appelées Jo et In, qui peuvent former un complexe covalent et peuvent donc être utilisées en biotechnologie. Cet outil permet d'étudier l'impact de la proximité spatiale des enzymes métaboliques et l'amélioration de l'activité en vue de la production de composés. Notre analyse RMN détaille le processus de formation des liaisons covalentes.Dans l'ensemble, nous présentons une plateforme permettant d'étudier le fonctionnement du métabolisme par le suivi en temps réel de CFE. Grâce à cette plateforme, nous étudions le contrôle exercé par les cofacteurs sur le métabolisme central d'E. coli et démontrons sa valeur pour comprendre et optimiser les systèmes métaboliques.

Life can be broken down into a defined set of chemical reactions that are catalysed by enzymes and compose a large, dense, and highly connected network called metabolism. Its study is essential to understand biological processes (e.g. stress response, adaptation…) and further control them (e.g. biotechnology, pharmacology). The regulation of the network is hierarchical, with protein expression levels and post-translational modifications playing an important role. However, the metabolites also play an active role, as reactions depend on the availability of substrates and products, and on long range interactions whereby metabolites have a regulatory effect on enzyme activity. Investigating this regulation is complex as the behaviour of the isolated reactions (i.e. purified enzymes) does not necessarily reproduce the regulatory aspects of the network. In situ analysis, ideally in live cells and in real time, is experimentally challenging because of the rapid timescale of the regulatory interactions, the vast range of metabolite concentrations, and the biological constraints of keeping a cell suspension in a stable metabolic state for analysis. Finally, the metabolic network within the cell is tight to external perturbation (e.g. addition of substrate, inhibitor…).One potential answer to the issues cited above is the use of active cell free extracts (CFE), obtained from the lysis of cells and subsequent separation of their soluble components. CFEs offer an easy to handle platform whereby metabolic reactions are part of the network, yet prone to simple perturbation. The metabolic reactions occurring in the CFE as response to a perturbation can then be studied using mass spectrometry or Nuclear Magnetic Resonance (NMR). The latter is a well-adapted and non-destructive tool allowing the identification and quantification of small organic molecules in a complex matrix, both at a given time point or throughout chemical reactions in real time.The work presented in this thesis is based on the hypothesis that studying the metabolic network in CFE in real-time can provide information about the functioning of the metabolic network. We focus on the E. coli central metabolism whose regulation is essential for biotechnology. We first adapt NMR analytical methods to monitor physicochemical parameters such as pH simultaneously to metabolite concentration during a chemical reaction (Chapter II). Focusing on the glycolytic metabolites in the CFE extract, we describe NMR sequences for the specific identification of phosphorylated metabolites in complex biological samples (Chapter III).Using these NMR methods to precisely monitor glycolysis in the E. coli CFE in real time, we first characterise preparation protocols, in terms of reproducible activity. We next study the glycolytic activity and pentose phosphate pathway/glycolysis partition in the CFE as a function of the cofactor pools and regeneration. Our results confirm that cofactors can have a strong influence on glycolytic flux, echoing what has been observed in vivo, but also suggest further hypotheses on the role of cofactors on central metabolism, thereby validate the use of CFE as a platform to study metabolic regulation.We used protein NMR spectroscopy to characterize two small proteins, called Jo and In, that can join into a covalent complex and can hence be used in biotechnology to staple enzymes together. This tool provides a way to study the impact of spatial proximity of metabolic enzymes, substrate channelling and improve activity towards compound production. Our NMR analysis further details the process of covalent bond formation, and thereby gives further hints as for the development of novel orthogonal pairs.Overall, we present a platform to study metabolism functioning by real-time monitoring of CFE. Using this platform, we investigate the control exerted by cofactors on E. coli central metabolism and demonstrate its value to understand and optimize metabolic systems.