Criblage à haut contenu à base d'ARNi et de produits chimiques pour la normalisation du phénotype XPC

par Farah Kobaisi

Thèse de doctorat en Modèles, méthodes et algorithmes en biologie, santé et environnement

Sous la direction de Walid Rachidi, Hussein Fayyad-Kazan et de Xavier Gidrol.

Soutenue le 15-07-2021

à l'Université Grenoble Alpes , dans le cadre de École doctorale ingénierie pour la santé, la cognition, l'environnement , en partenariat avec Institut de recherche interdisciplinaire de Grenoble (laboratoire) et de Biomicrotechnologie et génomique fonctionnelle (équipe de recherche) .

Le président du jury était Patrice Marche.

Le jury était composé de Walid Rachidi, Eva Hamade, Thierry Magnaldo.

Les rapporteurs étaient Jérôme Lamartine, Laure Favot-Laforge.


  • Résumé

    La Xeroderma Pigmentosium C (XP-C) est une génodermatose autosomique récessive rare. Les patients de cette pathologie sont porteurs d'une mutation dans la protéine XPC de reconnaissance des dommages de l'AND. Cette mutation génère un phénotype pathologique caractérisé par une photosensibilité extrême et l'accumulation de dommages à l'ADN induits par les UV. Par conséquent, l'objectif de ce projet est de cribler des molécules chimiques et biologiques afin d'identifier les hits qui peuvent inverser ce phénotype malade. Des cellules XP-C et normales dérivées de patients seront utilisées pour cribler une bibliothèque chimique de 1280 médicaments approuvés par la FDA ou une bibliothèque de siRNA visant à diminuer l'expression de toutes les kinases humaines, étant donné l'implication des kinases dans les différentes voies de réparation de l'ADN. Les cellules seront ensuite irradiées par des UVB pour induire des lésions de l'ADN, puis l'inversion phénotypique sera surveillée au niveau de la photosensibilité ou au niveau de la réparation des lésions de l'ADN pour visualiser quel traitement permet une diminution du niveau de lésions et donc une réparation. Une caractérisation plus poussée des effets des hits sera ensuite effectuée au niveau de l'apoptose et de la prolifération, par cytométrie de flux, et de la signalisation en aval via le western blot. Pour le criblage chimique, 1280 médicaments différents ont été utilisés pour traiter les cellules. Après l'induction de dommages à l'ADN, les cellules ont également été post-traitées avec les mêmes médicaments, puis incubées pendant vingt-quatre heures pour permettre leur récupération. La viabilité des cellules traitées a été. Seize médicaments ont permis une augmentation de plus de 25% de la viabilité des cellules. Ensuite, après le marquage des dommages à l'ADN et leur quantification, deux médicaments, l'isoconazole et le chlorhydrate de clemizole, ont permis de diminuer de 20% la quantité de dommages à l'ADN. L'un des deux médicaments, l'isoconazole, a permis de réduire la mort apoptotique des cellules XPC mais n'a eu aucun effet sur leur taux de prolifération. Le mode d'action connu des deux médicaments sélectionnés est un antifongique pour l'isoconazole et un antagoniste des récepteurs de l'histamine pour le chlorhydrate de clémizole. Cela n'explique pas leurs effets dans la protection des cellules XPC contre la mort induite par l'irradiation. Par conséquent, une étude plus approfondie du mécanisme d'action possible est nécessaire en comparant le profil d'expression des protéines des cellules traitées et non traitées afin d'identifier un nouveau mécanisme d'action possible pour ces deux médicaments. Quant à criblage biologique, une bibliothèque de siRNAs ciblant l'ensemble des kinases humaines a été utilisée pour traiter les XPC et les cellules normales, puis pour détecter si une inversion phénotypique se produit. 1292 siRNA différents ont été utilisés pour traiter les cellules XPC afin de les irradier et leur permettre de récupérer pendant 24 heures avant de mesurer leur viabilité. Vingt-huit siRNA différents ont été sélectionnés sur la base de leur capacité à induire une augmentation de 25 % de la viabilité cellulaire. Parmi eux, le ciblage de deux kinases a permis une réparation de 20% des dommages induits à l'ADN. Une kinase en particulier a eu un effet exclusif dans la photo-protection des cellules XPC et aucun effet sur les cellules normales. Le knock down de l'expression de la kinase induit par ce siRNA a été validé au niveau de l'ARNm par PCR et au niveau de la protéine par western blot. L'effet photo-protecteur de ce knock down de la kinase dans les cellules XPC a également été validé dans un test de réponse aux UVB. Le XPC est un excellent modèle pour comprendre l'initiation du cancer de la peau, car il est accéléré dans ces cellules. En améliorant ce phénotype, nous pouvons donc trouver des moyens de retarder ou de prévenir l'initiation du cancer.

  • Titre traduit

    RNAi and Chemical-Based High Content Screening for the Normalization of XPC Phenotyope


  • Résumé

    Xeroderma Pigmentosium C (XP-C) is a rare autosomal recessive genodermatosis. Patients with this disorder carry a mutation in the DNA damage recognition protein XPC belonging to the nucleotide excision repair (NER) pathway. This mutation generates a pathological phenotype characterized by extreme photosensitivity and accumulation of UV-induced DNA damage without repair. XP-C and normal patient-derived cells will be used to screen a chemical library of 1280 FDA-approved drugs or a library of siRNAs aimed at decreasing the expression of all human kinases, given the involvement of kinases in different DNA repair pathways. Cells will then be irradiated with UVB to induce DNA damage, and then the phenotypic reversal will be monitored for photosensitivity or for DNA damage repair to visualize which treatment results in a decrease in the level of damage and thus repair. Further characterization of the effects of the hits will then be performed at the level of apoptosis and proliferation, by flow cytometry, and of downstream signaling via western blot. The screening procedure was performed on XPC and normal cell lines. For chemical screening, 1280 different drugs were used to treat cells in duplicate in the wells of a 96-well plate. After induction of DNA damage, the cells were also post-treated with the same drugs and then incubated for twenty-four hours to allow recovery. The viability of treated cells was measured and compared to the positive control of untreated unirradiated cells and the negative control of untreated irradiated cells. Of the drugs tested in the library, sixteen drugs resulted in an increase of more than 25% in cell viability. Then, after DNA damage labeling and quantification, two drugs, isoconazole and clemizole hydrochloride, decreased the amount of DNA damage by 20%. Further characterization of these two drugs by separating the treatment into pre-irradiation or post-irradiation treatment revealed that post-irradiation was more effective in inducing photoresistance in XPC cells. One of the two drugs, isoconazole, reduced apoptotic death of XPC cells but had no effect on their proliferation rate. The known mode of action of the two selected drugs is an antifungal for isoconazole and a histamine receptor antagonist for clemizole hydrochloride. This does not explain their effects in protecting XPC cells from irradiation-induced death. Therefore, further investigation of the possible mechanism of action is needed by comparing the protein expression profile of treated and untreated cells to identify a possible new mechanism of action for these two drugs. As for biological screening. A library of siRNAs targeting all human kinases was used to treat XPCs and normal cells, and then to detect whether a phenotypic reversal occurs. 1292 different siRNAs were used to treat XPC cells to irradiate them and allow them to recover for 24 hours before measuring their viability. Twenty-eight different siRNAs were selected based on their ability to induce a 25% increase in cell viability compared to controls transfected with non-targeted siRNA. Among them, targeting two kinases resulted in a 20% repair of induced DNA damage. One kinase in particular had an exclusive effect in photoprotection of XPC cells and no effect on normal cells. The knock down of the kinase expression induced by this siRNA was validated at the mRNA level by PCR and at the protein level by western blot. The photo-protective effect of this kinase knockdown in XPC cells was also validated in a UVB response assay where it was able to induce higher viability in transfected XPC cells compared to non-transfected cells as a function of increasing UVB doses. The regulation of downstream signaling induced by the knockdown of this kinase is also studied by western blot. XPC is an excellent model to understand skin cancer initiation, as it is accelerated in these cells. By improving this phenotype, we can therefore find ways to delay or prevent cancer initiation.



Le texte intégral de cette thèse sera accessible librement à partir du 02-05-2022

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