Etude structurale et fonctionnelle des substances apparentées d’anticorps thérapeutiques

Structural and functional study of related substances of therapeutic antibodies.

• Auteur / Autrice : Grégory Rouby
• Direction : Myriam Taverna
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie
• Date : Soutenance le 17/12/2020
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences chimiques : molécules, matériaux, instrumentation et biosystèmes
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut Galien Paris-Saclay (Châtenay-Malabry, Hauts-de-Seine ; 1998-....)
• Partenaire(s) de recherche : référent : Faculté des sciences d'Orsay
• Jury : Président / Présidente : Philippe Billiald
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Julia Chamot-Rooke, Davy Guillarme, Isabelle Turbica, Gérald Perret
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Julia Chamot-Rooke, Davy Guillarme

Mots clés

Mots clés contrôlés

Résonance plasmonique de surface

Chromatographie

Dimères

Anticorps monoclonaux

Mots clés libres

MAb

Dimère

Spectrométrie de masse native

Chromatographie liquide

SPR

MAb

Dimer

Native mass spectrometry

Liquid chromatography

SPR

Résumé

Les anticorps monoclonaux (mAbs) sont des protéines complexes qui doivent être caractérisées de façon exhaustive en respectant la réglementation dictée par les autorités de santé pour assurer la sécurité et l'efficacité du produit. Les mAbs présentent une micro-hétérogénéité structurale principalement liée à des modifications post- traductionnelles mais également à des dégradations physiques et chimiques. L’instabilité des protéines peut être causée par une exposition à différents stress notamment pendant le processus de fabrication, de stockage et de transport. Parmi ces dégradations, l’agrégation, qui est fréquente, peut diminuer l’activité fonctionnelle de la protéine et générer des réponses immunes. Généralement, les premières étapes conduisant à la formation d'agrégats sont la dénaturation de la protéine et la formation de dimères. L'objectif de ma thèse était d'étudier la structure et la fonction des dimères formés à partir d'un anticorps thérapeutique spécifique, le roledumab. Plusieurs études réalisées sur différents mAbs ont révélé la présence de dimères covalents et non covalents ainsi que différents types d'association, en fonction des domaines impliqués dans cette dimérisation.Tout d'abord, les dimères présents en très faible quantité dans roledumab (<1%) ont été purifiés par chromatographie d'exclusion stérique (SEC). Des analyses d'électrophorèse capillaire et de SDS-PAGE ont été réalisées dans des conditions non réductrices afin d’estimer la proportion de dimères liés de manière covalente et non covalente. Ces expériences ainsi que des analyses en LC-MS en conditions natives ont révélé pour la première fois la présence de trois formes de dimères, les complexes covalents etant associés par des ponts disulfures.La SEC couplée à la MS à haute résolution a été utilisée, par approche middle-up, pour déterminer les domaines impliqués dans la dimérisation. Les résultats ont révélé que les dimères de roledumab étaient associés par le domaine Fab pour former des complexes de type Fab-Fab. Par ailleurs, une analyse par cartographie peptidique réalisée dans des conditions non réductrices a révélé la présence d'un nouveau pont disulfure, Cys23LC-Cys96HC, spécifique des dimères du roledumab. Enfin, l'impact de cette dimérisation sur la fonctionnalité a été étudié par la mesure de l’affinité des dimères aux récepteurs FcγRIII et par des tests cellulaires spécifiques. Les résultats ont montré que les dimères avaient une affinité plus élevée pour les récepteurs FcγRIII et une activité également plus élevée par rapport aux monomères.

Abstract : Therapeutics monoclonal antibodies (mAbs) are complex proteins that must be exhaustively characterized according to regulatory authorities requirements to ensure safety and efficiency of the product. MAbs display structural microheterogeneity mainly due to their post-translational modifications, but also to their susceptibility to chemical and physical degradations. Their instability can be caused from their exposure to different stresses during the manufacturing process, handling, and storage. Among these degradations, aggregation, which occurs quite frequently, can reduce therapeutic efficiency, and generate immunogenic responses. Commonly, the first steps leading to aggregation are protein denaturation and the formation of dimers. The objective of this thesis was to investigate the structure and function of the dimers present in a specific therapeutic mAb, roledumab. Several studies have shown, for different mAbs, the presence of both covalently and non-covalently bound dimers as well as different types of association, depending on the domains implicated in the dimerisation. The small amount of dimeric species (<1%) present in the unstressed roledumab product has been purified through a preparative Size Exclusion Chromatography (SEC). Capillary Electrophoresis and SDS-PAGE performed under non-reducing conditions have been used to estimate the proportion of non-covalently and covalently bound dimers. From these experiments, three different dimers were identified. SEC hyphenated to mass spectrometry was employed as a high-resolution middle-up approach to determine the mAb domains implicated in the dimerisation. Our results revealed that the roledumab dimers were associated by a single arm-bound Fab-to-Fab association. Furthermore, a peptide mapping analysis performed under non reducing conditions revealed the presence of a new disulphide bond, Cys23LC-Cys96HC, specific of the roledumab dimers. Finally, the impact of this dimerisation on the activity has been investigated measuring the affinity of the dimers to the Fc receptors and using specific bioassays. The purified dimers showed higher affinity for the Fc receptors and higher activity compare to the monomers.