Anomalies de la mitophagie au cours de la maturation érythroïde dans la drépanocytose

Deficient mitophagy pathways in sickle cell disease

• Auteur / Autrice : Suella Martino
• Direction : Caroline Le Van Kim
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Immunologie
• Date : Soutenance le 15/12/2020
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Biologie intégrée du globule rouge (Paris ; 2014-....)
• Jury : Président / Présidente : François Delhommeau
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Caroline Le Van Kim, François Delhommeau, Catherine Badens, Damien Roussel, Jean-Benoît Arlet
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Catherine Badens, Damien Roussel

Mots clés

Mots clés contrôlés

Protéines du choc thermique

Dégradation des mitochondries

Érythrocytes

immunologie

Drépanocytose

Gène PINK1

Mots clés libres

NIP3-like protein X (NIX)

Heat-shock protein 90 (Hsp90)

Sickle cell disease

Red blood cell

NIP3-like protein X (NIX)

PTEN-induced putative kinase 1 (PINK1)

Heat-shock protein 90 (Hsp90)

Mitophagy

Résumé

La drépanocytose, maladie génétique la plus fréquente au monde, est une hémoglobinopathie caractérisée par une anémie hémolytique chronique, des crises vaso-occlusives douloureuses et des atteintes multi-viscérales. Malgré les progrès considérables accomplis ces 10 dernières années, la caractérisation fine des acteurs cellulaires est incomplète, et l’arsenal thérapeutique reste encore faible. La mitophagie, qui est le processus d’élimination spécifique des mitochondries, est un élément clé de l’érythropoïèse tardive, contribuant à la production de globules rouges (GR) fonctionnels. Cependant, chez certains patients drépanocytaires, il a été observé des GR contenant des mitochondries (Jagadeeswaran et al., Exp. Hematol. 2017). Jusqu’à présent, cette population n’a pas été caractérisée et le mécanisme à l’origine de ce phénomène reste inconnu. Notre objectif a été d’identifier des patients drépanocytaires (génotype homozygote SS) présentant des GR contenant des mitochondries, d’étudier la fonctionnalité des mitochondries et le stress oxydant, et d’élucider le mécanisme sous-jacent. Nous avons réalisé, entre 2018 et 2020, une étude prospective sur une cohorte de 30 patients adultes drépanocytaires SS à l’état basal suivis à l’hôpital Européen Georges Pompidou. Nous avons détecté la présence de mitochondries dans les GR par cytométrie en flux, par western-blot (WB) et par microscopie électronique (ME). Nous avons distingué deux groupes de patients en fonction du pourcentage de GR contenant des mitochondries : le groupe >1.3% appelé groupe mito-SS positif (41.4% de la cohorte) et le groupe <1.3% appelé groupe mito-SS négatif. Nous avons également identifié un plus fort taux de mitochondries au sein de la population de réticulocytes totaux et jeunes dans le groupe de patients mito-SS positif, ce qui suggère une rétention des mitochondries dès le stade de réticulocytes jeunes. L’étude par cytométrie en flux et par ME des mitochondries présentes dans les GR a révélé qu’elles n’étaient pas fonctionnelles et produisaient peu de stress oxydant. L’activation des voies de la mitophagie a été étudiée par WB en examinant les protéines majeures de ce mécanisme, NIX et PINK1 qui interviennent dans le recrutement des membranes de l’autophagosome. Nous avons également analysé les protéines chaperonnes Hsp90, Hsp70 et Hsp60, qui, quant à elles, régulent la quantité de PINK1 à la membrane des mitochondries. Nos analyses de WB ont montré une diminution significative de NIX et de PINK1, ainsi qu’une surexpression d’Hsp90 dans les cellules érythroïdes du groupe de patients mito-SS positif comparé au groupe de patients mito-SS négatif. En résumé, nos résultats montrent la présence de GR contenant des mitochondries non fonctionnelles et produisant peu de stress oxydant chez des patients adultes SS. La diminution de NIX et PINK1 suggère fortement un défaut d’activation de la mitophagie qui pourrait expliquer la rétention mitochondriale dès le stade de réticulocytes jeunes. Des études ont montré que l’augmentation d’Hsp90 joue un rôle dans la régulation des voies médiées par le monoxyde d’azote (NO) dans les cellules endothéliales en augmentant la biodisponibilité du NO. Sachant que la diminution du NO contribue à la survenue des crises vaso-occlusives dans la drépanocytose, nous émettons l’hypothèse que la surexpression de cette chaperonne dans le groupe de patients mito-SS positif pourrait représenter un mécanisme compensatoire, via une augmentation du NO, participant ainsi à la prévention d’épisodes vaso-occlusifs dans le groupe de patients mito-SS positif. Bien que des études sur des cohortes plus importantes doivent absolument être menées, ces données mettent en évidence pour la première fois les protéines NIX, PINK1 et Hsp90 en tant que nouveaux acteurs moléculaires impliqués dans la physiopathologie de la drépanocytose.

Sickle cell disease (SCD), the most common genetic disease word-wide, is an inherited hemoglobinopathy characterized by chronic hemolytic anemia, vaso-occlusive crisis and acute pain with multi-organ damages. Despite growing progress during the last 10 years, the fine characterization of the cellular actors involved in the pathophysiology of SCD is still incomplete. Mitophagy pathway is a mitochondria-specific autophagy process essential for terminal erythroid maturation and to the production of functional red blood cells (RBCs). A recent study indicated some SCD patients retain mitochondria in their RBCs, but the characterization of these RBCs-containing mitochondria subpopulations (mito-RBCs) as well as the molecular mechanism leading to this organelle retention have never been explored (Jagadeeswaran et al., Exp. Hematol. 2017).The aims of my PhD project were to (i) identify SCD patients with mito-RBCs; (ii) study the functionality of these mitochondria and oxidative stress and to (iii) elucidate the mitophagy-based mechanism involved in mitochondria retention. We performed a prospective study between 2018 and 2020, using a cohort of 30 SCD adult patients (SS genotype) at basal state followed at the Georges Pompidou European Hospital. We identified mito-RBCs in some patients by flow cytometry and confirmed this data by western blot (WB) and electron microscopy (EM). We classified the SS patients in two groups according to their percentage of mito-RBCs: the >1.3% of mito-RBCs group was referred as mito-SS positive group (41.4% of the cohort), and the <1.3% of mito-RBCs group as mito-SS negative group. We also observed an elevated level of mitochondria in the total and the young reticulocytes in the mito-SS-positive group compare to the mito-SS-negative group, suggesting a retention of mitochondria at young reticulocyte stage. We showed by flow cytometry and EM that mitochondria in mito-RBCs patients are not functional and did not exhibit high oxidative stress, in contrast to mitochondria present in reticulocytes. The mito-SS positive group exhibited features of hemolytic biological phenotype, i.e. an elevated reticulocytosis, a higher level of free bilirubin and a low fetal hemoglobin level. We go further on the mitophagy mechanism in these patients by investigating the expression of the major mitochondrial NIX and PINK1 proteins, which play important role in the recruitment of autophagosome membranes. We also investigated the expression of chaperones Hsp90, Hsp70 and Hsp60, which regulate the expression of PINK1. Interestingly, we showed by WB that the level of NIX and PINK1 are decreased and the level of Hsp90 is increased in the erythroid cells of the mito-SS positive group compare to the mito-SS-negative group. In summary, we observed a specific retention of non-functional mitochondria in the mito-SS positive group of patients that exhibit a hemolytic biological phenotype. Our data strongly suggested that mitochondria retention in RBCs results from a defect of mitophagy induction related to NIX and PINK1 signaling pathways at young reticulocyte stage. Previous studies identified a role for Hsp90 in the pharmacological regulation of nitric oxide (NO)-mediated pathways such as vasorelaxation, by expressing the endothelial isoform of NO synthase, the major source of NO in endothelial cells. Thus, we suggest that the overexpression of Hsp90 by increasing NO could participate in a mechanism preventing vaso-occlusive episodes in SS mito-positive patients. Although studies on larger cohorts are needed, these data highlight for the first time mitophagy-related proteins and Hsp90 as new molecular actors involved in the pathophysiology of SCD.