Propriétés biochimiques de la Topoisomérase VI d’Ectocarpus siliculosus et ses facteurs accessoires potentiels

Biochemical properties of the Topoisomerase VI from Ectocarpus siliculosus and its potential accessory factors

• Auteur / Autrice : Julia Brinkmeier
• Direction : Bernard de Massy
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie Santé
• Date : Soutenance le 30/03/2020
• Etablissement(s) : Montpellier
• Ecole(s) doctorale(s) : Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé (Montpellier ; Ecole Doctorale ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : UPR 1142-Institut de Génétique humaine-IGH (Montpellier)
• Jury : Président / Présidente : Frédéric Baudat
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Bernard de Massy, Frédéric Baudat, Marc Nadal, Mathilde Grelon, Susana M. Coelho, Corentin Claeys Bouuaert
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Marc Nadal, Mathilde Grelon

Mots clés

Mots clés contrôlés

Génomique

Méiose

Recombinaison génétique

Mots clés libres

Recombinaison

Méiose

Reproduction

Stabilité du génome

Cassures de l’ADN

Recombination

Meiosis

Reproduction

Genome stability

DNA double strand breaks

Résumé

Les topoisomérases d'ADN (appelées topoisomérases) sont des enzymes essentielles qui jouent un rôle crucial dans les processus biologiques tels que la réplication, la transcription, la recombinaison, la réparation et le remodelage de la chromatine de l'ADN. Il existe de nombreuses familles de topoisomérases différentes qui gèrent les enchevêtrements d'ADN en induisant soit une cassure transitoire de l'ADN simple brin (type I), soit une cassure double brin (type II) suivie d'une étape de re-ligature. Ce projet de doctorat visait à déterminer et à analyser les activités biochimiques d'une famille de topoisomérases non caractérisées chez les eucaryotes, la Topoisomérase VI (TopoVI), et son homologue méiotique TopoVIL. Comme observé chez A. thaliana, chez l'eucaryote Ectocarpus siliculosus, on trouve non seulement TopoVIA et TopoVIB mais aussi leurs homologues méiotiques TopoVIA-Like (TopoVIAL), orthologue de SPO11, et TopoVIB-Like (TopoVIBL). Nous avons décidé de profiter de l'existence de TopoVI et TopoVIL chez E. siliculosus pour identifier les différences et les similitudes et pour avoir un aperçu de leurs activités catalytiques. Pour ce faire, les protéines TopoVI et TopoVIL recombinantes ont été co-exprimées dans des cellules d'insectes infectées par des baculovirus, puis un complexe protéique a été purifié en appliquant une purification par affinité en deux étapes et une chromatographie d'exclusion de taille. En outre, pour TopoVI, j'ai cherché à co-exprimer ses cofacteurs potentiels, E. siliculosus Bin4 et Rhl1, dans des bactéries pour les purifier et finalement les ajouter dans des tests d'activité biochimique. J'ai pu exprimer et purifier les protéines TopoVI et TopoVIL, mais avec un poids moléculaire natif suggérant une agrégation. J'ai pu exprimer la protéine Bin4 recombinante, mais dans notre système d'expression bactérien, elle reste agrégée. L'agrégation des protéines observée pourrait être due à la surexpression et/ou aux conditions de purification qui entraînent des protéines mal repliées. J'ai donc réalisé une expérience de traduction in vitro en collaboration avec Lionel Imbert (IBS, Grenoble). Cette a permis de produire la protéine Bin4 soluble, ce qui ouvre la possibilité de réaliser des tests biochimiques. Enfin, Henri-Marc Bourbon (CBI, Toulouse) a établi une phylogénie de TopoVI (et TopoVIL) chez les eucaryotes. Ici, je présente des données complémentaires à cette étude avec l’analyse des interactions entre TopoVIA, Bin4 et Rhl1 chez E. siliculosus par des tests de double-hybride chez la levure.

DNA topoisomerases (referred to as topoisomerases) are essential enzymes that play crucial roles in biological processes such as DNA replication, transcription, recombination, repair and chromatin remodeling. Many different topoisomerase families exist that manage DNA entanglements by either inducing a transient DNA single strand (type I) or double strand break (type II) followed by a re-ligation step. This PhD project aimed to determine and analyze the biochemical activities of an uncharacterized topoisomerase family in eukaryotes, Topoisomerase VI (TopoVI), and its meiotic homologue TopoVIL. As observed in A. thaliana, in the eukaryote Ectocarpus siliculosus not only TopoVIA and TopoVIB are found but also their meiotic homologues TopoVIA-Like (TopoVIAL), orthologous to SPO11, and TopoVIB-Like (TopoVIBL). We decided to take advantage of the existence of both TopoVI and TopoVIL in E. siliculosus to identify differences and similarities and to get insight into their catalytic activities. For this, tagged recombinant TopoVI and TopoVIL proteins were co-expressed in baculovirus infected insect cells followed by protein complex purification applying a 2-step affinity tag purification and size exclusion chromatography. Furthermore, for TopoVI, I aimed to co-express its potential co-factors, E. siliculosus Bin4 and Rhl1, in bacteria to purify them and ultimately add them in biochemical activity tests. I was able to express and purify both TopoVI and TopoVIL proteins but with a native molecular weight suggesting aggregation. I was able to express tagged recombinant Bin4 but in our bacterial expression system it remains aggregated. The observed protein aggregation might be due to the overexpression and/or to the purification conditions resulting in misfolded proteins. Therefore, I performed a cell-free in vitro translation experiment in collaboration with Lionel Imbert (IBS, Grenoble). From this, I obtained soluble Bin4 which opens for the possibility to perform biochemical assays. Finally, Henri-Marc Bourbon (CBI, Toulouse) has established a phylogeny of TopoVI (and TopoVIL) in eukaryotes. Here, I present complementary data to this study by monitoring the interaction between TopoVIA, Bin4 and Rhl1 in E. siliculosus by a Yeast-two-hybrid experiment.