Ultrasensitive detection of ricin-like proteins by innovative graphene-based sensors, using mass spectrometry

par Ioana Silvia Hosu

Thèse de doctorat en Électronique, microélectronique, nanoélectronique et micro-ondes

Sous la direction de Yannick Coffinier.

  • Titre traduit

    Détection ultrasensible de la toxine de ricine par des capteurs innovant à base de graphène, utilisant la spectrométrie de masse


  • Résumé

    Les attaques bioterroristes sont devenues plus fréquentes ces dernières années et le large éventail d’agents bioterroristes en fait un problème important à résoudre. La ricine appartient à la famille des protéines inactivant les ribosomes (RIP). Les RIP sont des toxines biologiques, solubles dans l’eau, qui peuvent être facilement extraites de plantes (ricine de Ricinus communis et abrine d’Abrus precatorius) ou de bactéries (toxine de Shiga). La ricine est composée de deux chaînes: la chaîne A de la ricine, une N-glycosidase induisant la toxicité par élimination de l’adénine (action de dépurination) de l’ARNr 28S des sous-unités ribosomales 60S, inhibant la synthèse protéique, et la chaîne B, une lectine qui se lie aux fragments de sucre spécifiques sur la membrane extracellulaire, assurant l'absorption de la toxine. Comme ils inhibent la synthèse des protéines, en fonction de la voie d'absorption et de la dose reçue, la mort peut survenir. En l'absence de contre-mesures efficaces, les méthodes de détection de ces toxines doivent être rapides, fiables, sélectives et sans aucune ambiguïté. Les méthodes actuelles qui sont principalement basées sur des méthodes comme le SERS, l’ELISA, la Colorimétrie et la SPR ne répondent pas à toutes ces exigences. Même si la spectrométrie de masse a été utilisée pour la détection de la ricine, elle ne peut pas être réalisée sans une longue et fastidieuse préparation d'échantillon. Dans ce travail, nous avons montré comment les matériaux à base de carbone (nanomurs de carbone) pourraient être appliqués comme matériaux nanostructurés pour la détection spécifique, rapide et simple de la ricine par désorption/ionisation laser de surface pour la détection par spectrométrie de masse (SALDI-MS). Tout d'abord, l'adéquation des nanoparticules de carbone en tant que bonne surface SALDI a été initialement étudiée pour des biomolécules plus petites. En ce qui concerne les protéines, la littérature a montré qu'elles sont difficiles à ioniser et à détecter avec la méthode SALD-MS, en raison de leur grand poids moléculaire. La capacité des CNWs à désorber et à ioniser les protéines a nécessité de nombreuses étapes d’optimisation. Pour ce faire, le cytochrome C a été utilisé comme protéine modèle. Enfin, des nanomurs de carbone alignés verticalement ont ensuite été modifiés à l'aide de sucres à lectine spécifiques (galactosamine), pour la détection spécifique de la chaîne B de la ricine dans des échantillons réels, tels que des boissons sans alcool et du sérum sanguin. Nous avons obtenu une limite de détection (80 ng/0.5 μL) soit trois fois inférieure à la dose létale médiane la plus faible (DL50 = 10 μg/kg). Cette détection peut être réalisée dans les 10 min. Dans la dernière partie, des résultats préliminaires concernant la mise au point d'outils analytiques bimodaux seront présentés. Il s'agit de combinaisons telles que: SPR (résonance plasmonique de surface)-MS, SERS (Spectroscopie Raman Exaltée de Surface)-MS et EC(Électrochimie)-MS. Une attention particulière a été portée sur la SPR-MS car elle permet d’obtenir des interactions quantitatives et moléculaires en temps réel (SPR) et une identification structurelle des analytes (MS). Les méthodes de dépôt suivantes (de matériaux de type graphène) sont avérées appropriées pour la détection des protéines: la méthode de surfactant à bulle d'oxyde de graphène, le transfert par voie humide de graphène CVD et le dépôt électrophorétique de graphène.Cette thèse décrit pour la première fois le développement d'un capteur de type SALDI-MS, capable de détecter la ricine à une dose inférieure à la dose mortelle chez l'homme et d'apporter ainsi une contribution importante à la lutte contre d'éventuelles attaques terroristes. L'étude systématique de différents paramètres qui influencent ce processus LDI-MS est également présenté. Les techniques bimodales présentent des alternatives intéressantes permettant de créer des outils analytiques plus puissants.


  • Résumé

    Bio-terroristic attacks have become more frequent in the past years and the wide range of bio-terroristic agents makes this an important issue to overcome. Ricin is part of the ribosome-inactivating proteins (RIP). RIPs are vegetable toxins, water soluble, which can be easily extracted from plants (ricin from castor beams, abrin from rosary pea) or from bacteria (Shiga toxin). These proteins are composed of two chains: ricin A chain, a glycosidase that insures the toxicity by removal of adenine (depurination) from the RNAr 28S from the 60S ribosomal subunits, followed by the inhibition of protein synthesis, and ricin B chain, a lectin that binds to specific sugar moieties on the surface of the cells, assuring transportation the cell uptake. As they inhibit protein synthesis, depending of the administration take-up (oral, inhalation, intravenously) and the dose received, cell death also occurs. In the absence of efficient counter measurements, detection methods of these toxins have to be fast, reliable, selective and suitable, especially pre-assimilation analysis. The current methods (based on SERS, ELISA, Colorimetric, SPR and MS) do not overcome all these requirements. Even though mass spectrometry was used for ricin detection, it cannot be performed without long and tedious sample preparation. In this work, we describe how carbon-based materials (carbon nanowalls and others) can be used as nanostructured materials for specific, rapid and straightforward ricin-like proteins detection, using surface assisted laser/desorption ionization mass spectrometry (SALDI-MS). The suitability of the carbon nanowalls (CNWS) was proven initially for other smaller bio-molecules.When it comes to proteins, they are hard to ionize and detect using SALD-MS, due in part to their big molecular weight. The ability of CNWs to desorb and ionize proteins required a lot of optimization steps of the SALDI-MS method. A systematic optimization was done using a model protein, the cytochrome C. From this, we were able, for the first time, to detect Ricin B chain without the use of organic matrix. To go further in improving Ricin detection performances, carbon nanowalls were then covalently modified using specific lectin sugars (galactosamine) and the ability to detect Ricin B chain in real samples such as soft drinks and blood serum was demonstrated within10 minutes. We obtained a limit of detection (80 ng/0.5 μL) that is 3 times lower than the lowest median lethal dose (LD50 = 10 μg/kg) Multifunctional surfaces are described as perspectives for more powerful bimodal analytical tools, by combining two techniques, such as: SPR(Surface Plasmon Resonance)/SALDI-MS, SERS(Surface Enhanced Raman Spectroscopy)/SALDI-MS and EC(Electrochemistry)/SALDI-MS. Special attention was focused on SPR/SALDI-MS as it can achieve both quantitative and molecular interactions in real-time (SPR) and precise identification of the analytes (MS). Different depositions methods of graphene-like materials were studied to ensure a good surface coverage of the substrate and the followings methods were suitable for protein detection: bubble surfactant method of graphene oxide, wet transfer of CVD pristine graphene, electrophoretic deposition of graphene.In this thesis, we described the first world wide ricin-like proteins SALDI-MS sensor, which is able to detect below the lethal dose in humans and bring an important contribution to the fight against eventual terroristic attacks. The systematic study of different parameters that influence this LDI-MS process is also presented. The dual surfaces studied, in particular the SPR/MS bimodal techniques, presented reliable consistency for further approaches in creating more powerful analytical tools.


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