Récepteurs gustatifs humains : étude des relations structure-fonction

par Christine Belloir (Dupont)

Thèse de doctorat en Biochimie et biologie moléculaire

Sous la direction de Loïc Briand et de Fabrice Neiers.

Le président du jury était Pascal Degrace.

Le jury était composé de Jérome Golebiowski.

Les rapporteurs étaient Gaëlle Guiraudie-Capraz, Axel Marchal.


  • Résumé

    Les détecteurs gustatifs aux saveurs sucré, umami et amer sont des récepteurs membranaires qui appartiennent à la famille des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG). Ils sont caractérisés par l’existence d’un domaine transmembranaire (DTM) hydrophobe et un mécanisme d’activation qui implique une protéine G hétérotrimérique.L’homme possède 25 récepteurs à l’amer TAS2R. Ces récepteurs appartiennent à la classe A des RCPG. Leur l’architecture est constituée d’un DTM structuré en 7 hélices  qui forment le site orthostérique de liaison des molécules amères. Le récepteur au goût umami est un hétérodimère composé des sous-unités TAS1R1 et TAS1R3, alors que les sous-unités TAS1R2 et TAS1R3 s’assemblent pour composer le récepteur au goût sucré. Chacune de ces sous-unités appartient à la classe C des RCPG et partage une architecture commune, constituée d’un domaine N-terminal (DNT) extracellulaire de grande taille qui est relié au DTM par une région riche en cystéines (RRC). La contribution de chaque sous-unité au fonctionnement des récepteurs hétérodimériques demeure cependant largement inconnue.A cause de leur nature amphipathique, les RCPG constituent une famille de protéines extrêmement difficiles à étudier d’un point de vue biochimique. Caractériser leurs interactions et déterminer leurs structures sont des enjeux importants et un véritable challenge pour les années à venir. Dans ce travail, nous avons développé différents systèmes d’expression afin de mieux comprendre les mécanismes moléculaires qui gouvernent les interactions récepteur-ligand.Pour l’étude du goût umami, les DNT de TAS1R1 et TAS1R3 ont été produits en bactérie E. coli sous forme de corps d’inclusions puis repliés in vitro. En combinant des approches biochimiques et des tests cellulaires d’activité fonctionnelle, nous avons montré que l’inosine-5’-monophosphate (IMP), un exhausteur du goût umami, se lie à TAS1R3-DNT et agit en synergie avec le sucralose et le néotame.Concernant le récepteur au goût sucré, la sous-unité (taille complète) de TAS1R2 a été surexprimée dans une lignée cellulaire HEK293S inductible par la tétracycline. Un protocole de solubilisation et de purification a permis d’obtenir le récepteur TAS1R2 fonctionnel. Une analyse par dichroïsme circulaire dans l’UV lointain a révélé que TAS1R2 est bien replié. La diffusion de lumière couplée à la gel filtration a montré que TAS1R2 était présent majoritairement sous forme dimérique. Les interactions avec les ligands sucrés mesurées par fluorescence intrinsèques ont révélé des affinités de l’ordre du micromolaire en accord avec les tests d’activité cellulaires et les pouvoirs sucrants des molécules.Parallèlement, afin d’étudier les récepteurs au goût amer, nous avons conçu différents vecteurs d’expression du récepteur TAS2R14 afin d’améliorer son expression et son adressage à la membrane plasmique. Nous avons montré que l’utilisation de la séquence QBI SP163 en amont du codon initiateur de traduction, associée au peptide signal de la somatostatine 3 de rat en position N-terminale et à l’étiquette FLAG en position C-terminale, permettait d’augmenter la réponse fonctionnelle du récepteur aux ligands amers aussi bien en termes d’amplitude que de sensibilité. Cette construction plasmidique représente un outil prometteur pour aider à identifiés certains agonistes des TAS2R orphelins.

  • Titre traduit

    Human taste receptors : study of structure-function relationships


  • Résumé

    Sweet, umami and bitter taste detectors are membrane receptors that belong to the family of G-protein coupled receptors (GPCRs). They are characterized by the existence of a hydrophobic transmembrane domain (TMD) and an activation mechanism that involves a heterotrimeric G protein.Human has 25 bitter taste receptors TAS2R. These receptors belong to class A GPCRs. Their architecture consists of a TMD structured in 7 -helix which form the orthosteric binding site of bitter molecules. The umami taste receptor is a heterodimer composed of the TAS1R1 and TAS1R3 subunits, while the TAS1R2 and TAS1R3 subunits form the sweet taste receptor. Each subunits belongs to the class C GPCRs and shares a common architecture, consisting of a large extracellular N-terminal domain (NTD) connected to the TMD by a cysteine-rich region (CRR). However, the relative contribution of each subunit to the heterodimeric receptors function remains largely unknown.Because of their amphipathic nature, GPCRs are extremely difficult to study from a biochemical point of view. Characterizing their interactions and determining their structures are important issues and a real challenge for the next years. In this work, we have developed different expression systems to understand molecular mechanisms that govern receptor-ligand interactions.For the study of umami taste, the TAS1R1 and TAS1R3 NTDs were produced in E. coli bacteria as inclusion bodies and then folded in vitro. By combining biochemical approaches and functional cell assays, we have shown that inosine-5'-monophosphate (IMP), an umami flavor enhancer, binds to TAS1R3-NTD and acts synergistically with sucralose and neotame.Regarding the sweet taste receptor, the subunit (full size) of TAS1R2 was overexpressed in a tetracycline inducible cell line HEK293S. Solubilization and purification protocol allows to obtain functional TAS1R2 receptor. Far-UV circular dichroism spectroscopy analysis revealed that TAS1R2 is well folded. Multiangle light scattering coupled with gel filtration showed that TAS1R2 was predominantly present in dimeric form. Interactions with sugar ligands measured by intrinsic fluorescence revealed micromolar range affinities in agreement with cellular assays and the sweetening powers of molecules.In parallel, to study bitter receptors, we designed different TAS2R14 receptor expression vectors in order to improve receptor expression and target to the plasma membrane. We showed that use of the QBI SP163 sequence upstream of the translational initiation codon, associated with the signal peptide of the rat somatostatin 3 in the N-terminal position and the FLAG tag in the C-terminal position, increase the functional response of the receptor to bitter ligands both in terms of amplitude and sensitivity. This plasmid construct represents a promising tool to help identify some orphaned TAS2R agonists.



Le texte intégral de cette thèse sera accessible librement à partir du 31-12-2021

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