Conséquences de la stabilisation des G-quadruplex (G4) dans le génome humain ; une approche multi-omique

Impact of G-quadruplex (G4) structure stabilisation on the human genome; a multi-omics approach

• Auteur / Autrice : Emilia Maria Puig Lombardi
• Direction : José Arturo Londoño Vallejo, Alain Nicolas
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Génomique
• Date : Soutenance le 17/09/2019
• Etablissement(s) : Paris Sciences et Lettres (ComUE)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Complexité du vivant (Paris)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Dynamique de l'information génétique : bases fondamentales et cancer (Paris ; 2009-....) - Dynamique de l'information génétique : bases fondamentales et cancer
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Institut Curie (Paris ; 1978-....)
• Jury : Président / Présidente : Stéphane Le Crom
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : José Arturo Londoño Vallejo, Alain Nicolas, Stéphane Le Crom, Marcel Tijsterman, Sara Richter, Marie-Paule Teulade-Fichou, Francesco Iorio, Gaëlle Lelandais
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Marcel Tijsterman, Sara Richter

Mots clés

Mots clés libres

Bioinformatique

G-Quadruplex

Ngs

Non-B DNA

Instabilité génétique

Génomique

Bioinformatics

G-Quadruplex

Ngs

ADN non-B

Genomic instability

Genomics

Résumé

Les G-quadruplex (G4), structures secondaires pouvant être adoptées par les acides nucléiques, jouent des rôles biologiques dans de nombreux processus cellulaires : maintenance des télomères, réplication cellulaire et virale, réarrangements génomiques, réponse au dommages de l’ADN, régulation transcriptionnelle. Dans le génome humain, il existe une forte présence de séquences potentiellement capables de former des G4 et, en fonction des algorithmes de recherche utilisés pour les identifier in silico, le nombre de motifs est variable et peut atteindre plusieurs centaines de milliers. Récemment, le développement de ligands qui se lient spécifiquement aux G4 et sont capables de stabiliser ces structures, permettrait de moduler leur formation in vivo et donc d’étudier les processus biologiques associés et de développer des agents anti-cancéreux visant des proto-oncogènes.Des travaux menés dans notre unité, basés sur un modèle levure (insertion de la séquence du minisatellite humain CEB25 dans le génome de Saccharomyces cerevisiae), ont montré que les divers motifs G4 ne sont pas tous capables d’induire de l’instabilité génétique et qu’ils n’ont pas le même comportement vis-à-vis des ligands. En particulier, les G4 composés de boucles courtes - dits G4-L1, du type G3N1G3N1G3N1G3, sont beaucoup plus stables in vitro (Tm > 70°C) et corrélativement sont plus instables in vivo. Ces observations mènent à la question de comment ces motifs ‘à risque’ se forment in vivo, sont maintenus dans les génomes et comment ils évoluent. Pour aborder ces questions, nous avons mis au point et employé des approches expérimentales et bio-informatiques pour : (1) localiser, annoter et comparer les motifs G4-L1 dans le génome humain, en utilisant le génome de référence hg38 et les données du projet 1000 Génomes pour évaluer leur polymorphisme, ainsi qu’examiner leur maintien dans plus de 500 espèces ; (2) caractériser le potentiel mutagène des G-quadruplex par une approche de capture-NGS (séquençage à très haute profondeur), en utilisant diverses lignées cellulaires humaines traitées par des ligands de G4 (notamment, les ligands de la famille de PhenDC produits à l’Institut Curie) ; et (3) améliorer notre compréhension des rôles des G4 stables dans la transcription, en associant l'expression génique à la fréquence de motifs G4 canoniques présents autour des TSS, par des analyses combinées de génomique/traitements avec des ligands dans des cellules de fibrosarcome.

Nucleic acid G-quadruplex (G4) secondary structures play important biological roles in multiple cellular processes (telomere maintenance, cellular and viral replication, genome rearrangements, DNA damage response, epigenetic, transcriptional regulation). G4 potential motifs are scattered throughout the genome and, depending on the algorithms used to identify them in silico, their number varies and may reach several hundreds of thousands. Recently, the development of small molecules able to stabilise these structures opened the possibility of probing and/or interfering with their formation, allowing to examine the associated biological processes and developing anti-cancer agents. Work in our research unit, using natural and site-directed mutated human minisatellite sequences in yeast treated with different G4 ligands, showed that not all G4 sequences display the same potential to induce G4-dependent genome instability during replication. Namely, G4 structures carrying very short interconnecting loops between the G-runs are more stable in vitro and correlatively, are more prone to trigger genome instability in vivo. At the extreme, the G4s with the consensus G3N1G3N1G3N1G3 motif (where N is any nucleotide) – herein called G4-L1 – carry the higher potential to fold and trigger instability. This raises the unresolved questions of how these ‘at risk’ sequences are formed in vivo, maintained in genomes and how they evolve. To address these issues, we have used up–to-date bioinformatics, analytical and biological approaches to: (1) map, annotate and compare G4-L1 motifs in the human genome, using the hg38 reference and the 1000 Genomes project variation information to assess common polymorphism, as well as examine their maintenance across over 500 species; (2) characterize, using various human cell lines and Next Generation Sequencing (NGS) approaches, the potential of these sequences to mutate or induce perturbations upon treatments with G4 ligands; and (3) to improve our understanding of the roles of stable G4s in transcription, we have associated gene expression with the frequency of canonical G4 motifs near gene by combined G4 ligand/genomic analyses in fibrosarcoma cells.