L'apport du séquençage à haut débit dans la recherche de nouvelles associations génotype-phénotype dans les myopathies : cas particuliers des titinopathies

par Raul Morales

Thèse de doctorat en Biologie Santé

Sous la direction de Michel Koenig et de Mireille Cossée.

Le président du jury était Shahram Attarian.

Le jury était composé de Michel Koenig, Mireille Cossée, Shahram Attarian, Pascal Laforêt, Martin Krahn, Serge Lumbroso.

Les rapporteurs étaient Pascal Laforêt, Martin Krahn.


  • Résumé

    L’apport du séquençage à haut débit dans la recherche de nouvelles associations génotype-phénotype. Cas particulier des titinopathies.Les myopathies sont un groupe de pathologies hétérogènes sur le plan phénotypique et génétique, avec actuellement plus de 150 gènes identifiés. Compte tenu de cette grande hétérogénéité, de l’existence de gènes de grande taille et de l’absence d’une nette corrélation phénotype-génotype, l’approche classique d’étude gène par gène (technique Sanger) était très chronophage et d’une efficacité limitée. Le séquençage de nouvelle génération a révolutionné leur diagnostic en permettant de séquencer, en un seul temps, l'ensemble des séquences d'intérêt de plusieurs gènes, incluant les gènes de grande taille. La problématique actuelle est que la mise en place de la technique de NGS à visée diagnostique a confronté les laboratoires de diagnostic génétique à des difficultés dans l’interprétation des nombreux variants de séquence retrouvés pour chaque patient.Nous avons analysé par NGS une cohorte de 156 patients atteints d’une myopathie non étiquetée après avoir éliminé les principales hypothèses cliniques par des recherches d’un seul gène par la technique Sanger ou par de mini-panels de gènes. Des variants pathogènes ou probablement pathogènes ont été identifiés chez 74 des 156 patients (47,4%). Un des résultats les plus significatifs de notre étude est le pourcentage très élevé de diagnostics positifs chez les patients de moins d’un an présentant une hypotonie néonatale avec atteinte respiratoire. Notre approche a permis de confirmer le diagnostic chez 82% des cas. Une des conséquences du travail a été la proposition de faire un NGS en première intention chez ce type de patients ce qui permettra de pouvoir réaliser une prise en charge adaptée et un conseil génétique approprié aux parents.Un autre résultat très intéressant a été l'identification de nouvelles associations phénotypes/génotypes dans environ 10% des cas. Nous les avons classées en trois catégories : 1) Phénotype modéré par rapport à la sévérité clinique habituelle associée aux variants pathogènes dans le gène en cause. 2) Phénotype élargi si les symptômes n’avaient pas été décrits précédemment et 3) Variants dans un gène récemment impliqué dans les myopathies. La deuxième partie du travail concernait l’analyse de 13 familles par WES, (séquençage de toutes les régions codantes de l’ADN) pour lesquelles le NGS sur panel de gènes était négatif. Nous avons pu confirmer le diagnostic uniquement chez une famille. Ce résultat est en accord avec les données de la littérature, qui montrent que l’efficacité du WES n’est pas supérieure à celle du NGS sur panel de gènes. La troisième partie de la thèse était focalisée sur l’étude du gène TTN qui représente un exemple des difficultés d’interprétation des variants issus de l’analysé par NGS, étant donné la grande taille du gène avec 364 exons et la présence importante des variants dans la population générale. Nous avons mis en place dans le laboratoire un projet dont l’objectif général a été de développer une approche intégrée phénotype-hérédité-génotype-transcrits-protéine. Un des éléments principaux est l’étude des conséquences des variants TTN sur les transcrits et sur la quantité et la taille de la protéine par WB. Les études réalisées chez des patients atteints de formes de transmission récessive de titinopathie congénitale a montré des effets complexes, avec plusieurs populations de transcrits. Par ailleurs, nous avons pu établir une nouvelle corrélation génotype-phénotype chez une famille avec phénotype de myopathie distale à prédominance postérieure qui portaient une délétion hétérozygote des exons 11 à 18 du gène TTN. A notre connaissance, ce phénotype particulier n’a pas été rapporté jusqu’à présent dans la littérature

  • Titre traduit

    Analyse of results of Next Generation Sequencing from an undiagnosed muscular disease patients cohort. Titinopathies


  • Résumé

    Unravelling new phenotype/genotype correlations in myopathies with next generation sequencing. TitinopathiesNext-generation sequencing (NGS) is a revolutionary technology that allows the simultaneous analysis of multiple genes. The main NGS challenge is the clinical interpretation of the molecular findings to differentiate pathogenic, likely pathogenic, and non-clinically significant DNA variants. The purpose of this study was the detection of gene variants that cause myopathy in a cohort of 156 pediatric and adult patients by targeted NGS. We identified a pathogenic variant in 74 of the 156 patients (47.4%). The highest rate of positive diagnosis was in patients with congenital myopathies. Particularly, 82% of patients with severe hypotonia at birth had a pathogenic variant, suggesting that NGS should be considered the first diagnostic tool in this group. The most interesting result was the identification in 10% of patients of new or unusual phenotype/genotype associations concerning several genes. In some cases, this contributed to expand the phenotype associated with a specific gene. In the others, the disease severity or the inheritance mode differed from the classical clinical descriptions. The stepwise diagnostic methodology used in this work and the selected patient population could explain the remarkably high percentage of expanded phenotype-genotype associations (more than 10% of cases). Indeed, in addition to the classical in silico predictions of the variant and familial segregation, the procedure for validating the association between atypical or incomplete phenotypes and a genetic variant included also deep phenotyping (i.e., detailed clinical examination, whole-body muscle MRI, and additional techniques for muscular biopsy analysis, such as electron microscopy), multidisciplinary concertation, exhaustive and continuous literature update and if necessary, advice from international laboratories that are experts in specific genes.Since the widespread use of Next Generation Sequencing (NGS), the exhaustive analysis of the 364 exons of the TTN gene revealed an increasingly number of reported TTN variants. However, it is often difficult to assess the pathogenicity of the identified variants, in particular missense ones, due to the clinical heterogeneity of the pathology, the large size of the gene, the frequency of TTN variants in the general population. The aim of the study is to develop a workflow for interpreting TTN variants. This workflow is based on deep phenotyping, evaluation of the effects of TTN variants predicted to affect transcription and/or splicing on skeletal muscle titin transcripts, and evaluation of the consequences of some variants on protein by Western Blot studies. Our study highlights the importance of analyzing the consequences of variants not only on protein, but also on transcripts, to have an exhaustive understanding of the consequences of variants at the transcriptional and protein level.

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