Identification de nouveaux acteurs dans l’adaptation du kératinocyte humain aux changements mécaniques de son environnement

par Choua Ya

Thèse de doctorat en Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie

Sous la direction de Romain Debret et de Bérengère Fromy.

Soutenue le 31-01-2019

à Lyon , dans le cadre de École Doctorale Interdisciplinaire Sciences-Santé. (Villeurbanne) , en partenariat avec Institut de biologie et chimie des protéines (IBCP) (laboratoire) et de Université Claude Bernard (Lyon) (établissement opérateur d'inscription) .

Le président du jury était Fabienne Braye.

Le jury était composé de Romain Debret, Bérengère Fromy.

Les rapporteurs étaient Muriel Cario-André, Laurence Michel, Yves Poumay.


  • Résumé

    L'homéostasie épidermique repose sur différents paramètres dont les propriétés mécaniques du tissu de soutien, le derme, et les tensions intrinsèques dans le tissu épithélial. Lors de la cicatrisation, l'augmentation de la rigidité cutanée résultante peut perturber les conditions initiales de l'homéostasie. Afin de mieux comprendre les mécanismes cellulaires dans ce contexte physiopathologique, et l'incidence des propriétés mécaniques du derme sur le comportement du kératinocyte humain, des cellules primaires ont été cultivés à la surface d'hydrogels de polyacrylamide de différentes rigidités, et sur le plastique (> GPa), condition in vitro classiquement utilisée. Nos résultats ont mis en évidence que les substrats les plus mous favorisent un arrêt de prolifération et un profil phénotypique similaire à un kératinocyte différencié, alors que les substrats les plus rigides facilitent l'adhérence et la prolifération au détriment de la capacité de différenciation, et ce de façon graduelle. L'analyse transcriptomique par séquençage haut débit a permis d'identifier un récepteur membranaire orphelin couplé à la protéine G, GPRC5A (G Protein-Coupled Receptor Class C Group 5 Member A) et une protéine du cytosquelette, la spectrine beta III, dont les augmentations d'expression sont corrélées à l'augmentation de la rigidité. In vivo, GPRC5A est exclusivement localisé dans les berges de la plaie, lieu des kératinocytes en migration. Ces observations ont été confirmées par l'utilisation d'outils d'ARN interférence (siRNA et shRNA) dirigés contre GPRC5A dans les kératinocytes humains, montrant l'implication de ce récepteur dans l'adhérence et la migration cellulaire. De plus, les résultats montrent que la diminution de GPRC5A entraine un défaut de différenciation et d'organisation du feuillet épidermique, conduisant notamment à une mort cellulaire accrue, dans un modèle d'épiderme reconstruit. En parallèle, par des approches similaires d'ARN interférence dirigée contre le gène SPTBN2 (spectrin beta non-erythrocytic 2) codant pour la spectrine beta III, les résultats mettent en évidence un rôle fonctionnel de la spectrine beta III dans la prolifération cellulaire, l'étalement, la migration des kératinocytes et participe à la mécanotransduction en réponse à la rigidité en permettant la survie cellulaire. L'ensemble des résultats de la thèse montrent une adaptation phénotypique des kératinocytes dépendante de la rigidité du substrat sur lequel ils se trouvent et positionne GPRC5A et la spectrine beta III comme des acteurs clés dans la réponse du kératinocyte primaire humain aux changements mécaniques. Ces résultats permettent d'ouvrir de nouvelles voies stratégiques pour le traitement de la cicatrisation et plus largement dans les pathologies affectant la mécanique cutanée

  • Titre traduit

    Identification of new actors in the adaptation of the human keratinocyte to the mechanical changes in its environment


  • Résumé

    Epidermal homeostasis is determined by several characteristics, including dermis mechanical properties. During skin wound healing, dermis mechanical properties are modified and can alter epidermal integrity. Accordingly, it is essential to understand how keratinocytes respond and adapt to mechanical changes; however, these mechanisms remain unclear. To investigate how mechanical properties of cell microenvironment affect the human keratinocyte, primary cells were seeded on polyacrylamide hydrogels of different compliances (soft: 4 kPa, medium: 14 kPa, rigid: 45 kPa) in comparison with glass coverslip (> GPa). The results showed that on the softer hydrogel, keratinocyte spreading and proliferation were strongly decreased, while a strong increase in the expression of late differentiation markers was observed. On the contrary, the stiffer substrates promote adhesion and proliferation. Moreover, a transcriptomic profiling analysis reveals G protein-coupled receptor, class C, group 5, member A (GPRC5A) and spectrin beta non-erythrocytic 2 (SPTBN2) as potential mechanosensors for substrate adaptation of the keratinocyte. Actually, GPRC5A and SPTBN2 gene expression levels are associated with stiffness increase. We have characterized a dynamic relocation of GPRC5A during keratinocyte adhesion. Furthermore, the knockdown of GPRC5A increased cell adhesion and reduced cell migration. These results were confirmed by GPRC5A immunostaining in healing wounds from mice skin, showing a transient and specific expression of GPRC5A at wound leading edges, a site of cell migration, thus strengthening a role of GPRC5A in the keratinocyte migration process. Concerning SPTBN2, the knockdown of SPTBN2 decreased cell proliferation, spreading and migration, indicating a functional role in keratinocyte processes. Moreover, SPTBN2 knockdown induced keratinocyte death on soft substrate. In conclusion, we demonstrated an adaptive response of keratinocytes depending on substrate stiffness. We also found a new function of GPRC5A in keratinocyte process during skin wound healing and a mechanosensor role of SPTBN2 in keratinocyte. All of these results place GPRC5A and SPTBN2 as key regulators in the response to mechanical changes. These results pave new strategic pathways in skin wound healing treatment, and more widely in the pathologies affecting cutaneous mechanics

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