Caractérisation de la biodiversité des souches d'Aspergillus de la section Flavi isolées d'aliments commercialisés au Liban : approche moléculaire, métabolique et morphologique

Morphologic, molecular and metabolic characterization of Aspergillus section Flavi in marketed Food in Lebanon

• Auteur / Autrice : Joya Makhlouf
• Direction : Jean-Denis Bailly, Monzer Hamze
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Pathologie, Toxicologie, Génétique et Nutrition
• Date : Soutenance le 11/07/2019
• Etablissement(s) : Toulouse, INPT en cotutelle avec Université Libanaise
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences écologiques, vétérinaires, agronomiques et bioingénieries (Toulouse)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Toxalim (Toulouse ; 2011-....)
• Jury : Président / Présidente : Ziad Daoud
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Jean-Denis Bailly, Monzer Hamze, Jérôme Mounier, Mireille Kalassy aouad, Olivier Puel
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Jérôme Mounier, Mireille Kalassy aouad

Mots clés

Mots clés contrôlés

Aspergillus

Biodiversité

Aflatoxines

Mots clés libres

Aflatoxine

Aspergillus section Flavi

Potentiel toxinogène

Acide cyclopiazonique

Aliments commercialisés au Liban.

Aspergillus section Flavi

Diversity

Lebanon

Phenotype

Spices

Toxinogenesis

Résumé

Les mycotoxines sont des métabolites secondaires produits par certaines espèces de moisissures au cours de leur développement. Parmi ces composés, les aflatoxines (AF) (synthétisée par l’Aspergillus section Flavi), dont l’AFB1 qui est certainement la plus importante. C’est la seule mycotoxine classée dans le groupe I des composés carcinogènes pour l’homme et l’animal (surtout cancer hépatique). En outre, elle joue un rôle très important dans les retards de croissance observés chez les enfants et dans l’immunosuppression. L’aflatoxine est produite par des espèces fongiques appartenant au genre Aspergillus, précisément par les Aspergillus de la section Flavi. Anciennement, on a considéré que cette section était constituée par 3 espèces A. flavus, A. parasiticus et A. nomius. Maintenant, et grâce au progrès de la biologie moléculaire et métabolique, on peut dire que cette section est en fait beaucoup plus complexe et comprenne une vingtaine d’espèces dont on peut les différenciées selon leurs caractères morphologique ainsi que leurs capacités de produire de divers toxines.A ce jour-là, il n’y a que très peu de données discutant la contamination des produits agricoles commercialisés au Liban, ainsi que leur niveau de contamination par les Aspergillus de la section Flavi. L’objectif de nos travaux est de caractériser et d’étudier la biodiversité des souches d’Aspergillus de cette section isolées à partir de différents substrats tel que : les épices, céréales et fruits secs commercialisées au Liban.Dans ce but, 80 échantillons de 14 épices différentes ont été collectés à partir de différents marchés de la totalité du territoire libanais : poivre libanais, curry, curcuma, poivre noir, cannelle, gingembre, carvi, cumin, poivre blanc, anis, coriandre, chili, noix de muscade, bhar al kaak. Une analyse de la contamination fongique total a été réalisée et un ensemble de cinquante-trois souches d’Aspergillus de la section Flavi ont été isolées. En outre, 41 échantillons de céréales et de fruits secs ont été examinés, ainsi que l’isolement de 16 souches a été réalisé. Les souches ont été analysées à la fois morphologiquement, métaboliquement (HPLC) et moléculairement (PCR). Le pourcentage de la contamination fongique globale observés été variable en fonction de la nature des épices, des céréales et des fruits secs: Ce sont les échantillons de chili qui étaient les plus souvent contaminés par des souches d’Aspergillus de la section Flavi, ensuite c’étaient les échantillons de Bhar Al Kaak et du poivre noir. A l’inverse, certaines épices (cannelle, gingembre) semblent quasiment non contaminées par ces espèces. Parmi les céréales et les fruits secs successivement, les échantillons de maïs et d’arachide étaient les plus souvent contaminés. Pour être plus efficace, des analyses moléculaires ont été réalisées par PCR en se servant de 3 gènes: ITS (1-2), ITS (4-5) et bêta-tubuline. Ce qui nous a permis de confirmer les résultats de la morphologie. Comme conclusion, nos travaux montrent que les produits commercialisés au Liban semblent être très contaminés par des souches d’Aspergillus de la section Flavi toxinogènes, et que la plupart des isolats correspond à des souches d’Aspergillus de l’espèce flavus, susceptibles de produire à la fois de l’aflatoxine B1 et/ou de l’acide cyclopiazonique

Spices can be contaminated with various hazards , among which toxigenic fungi are probably the most important. Indeed, some fungal species produce toxic secondary metabolites namedmycotoxins as they develop on human food and animal feed . Among the hundreds of known mycotoxins, aflatoxins are the major ones for public health because they are the most potent of the known natural carcinogens, and the International Agency for Research on Cancer classified aflatoxin B1 (AFB1) in the group of molecules that are carcinogenic for both humans and animals (group 1). Chronic exposure to AFB1 is a major cause of hepatocarcinoma and this food contaminant has been associated with the highest number of DALYs (deaths and disability adjusted life years). Aflatoxins may contaminate many foods including cereals, dry fruits, and groundnuts. They are also frequent contaminants of spices. Indeed, spices are mainly produced in areas where both temperature and humidity favour fungal development and subsequent toxinogenesis. Methods of post-harvest processing (sun drying, handling, storage) can also allow secondary contamination and the development of moulds. Previous studies have demonstrated that spices can be contaminated by mycotoxins and thus represent a direct source of exposure for consumers, as recapitulated in a recent review. That is why spices are specifically concerned by regulations on aflatoxins. For instance, the E.U. regulation restricts contamination to 10 µg/kg for total aflatoxins and 5 µg/kg for AFB1. However, contamination of spices may exceed regulations and justify the withdrawal of contaminated products. As an illustration, in 2016, the European Rapid Alert System for Food and Feed recorded 79 notifications of mycotoxin contamination of spices and herbs, most of which corresponded to the presence of aflatoxin B1 at levels exceeding European limits. Aflatoxins are produced by different fungal species that belong to the genus Aspergillus and more specifically to the Flavi section. For years, three main aflatoxigenic species were commonly considered in the section Flavi: A. flavus, A. parasiticus and A. nomius. In the last decade, the use of molecular tools enabled the identification of new species belonging to the section Flavi, comprising 33 different species, of which 16 are aflatoxigenic. These species can be distinguished by subtle morphological specificities, molecular changes in some gene sequences, and, most importantly, through their ability to produce different mycotoxins. Indeed, some species, including A. flavus, A. pseudotamarii and A. togoensis, produce aflatoxins of B type, produce both B and G type aflatoxins. Some species may also produce other toxic secondary metabolites such as cyclopiazonic acid. So the aim of this study was to finely characterize the Aspergillus section Flavi that can contaminate spices marketed in Lebanon and to determine the toxigenic potential of the isolated strains. Spices are used extensively in Lebanon not only to flavour foods but also for their medicinal properties. To date, no data are available regarding the nature of the toxigenic fungal species that may contaminate these products at the marketing stage in this country. Eighty samples corresponding to 14 different types of spices were collected throughout Lebanon to characterize the Aspergillus section Flavi contaminating foodmarketed in Lebanon. Most fungal genera and species were identified as belonging to Aspergillus section Flavi. Aspergillus flavus was the most frequent species, representing almost 80% of the isolates. Although identified as A. flavus by molecular analysis, some strains displayed atypical morphological features. Seven strains of Aspergillus tamarii and one Aspergillus minisclerotigenes were also isolated. Analyses of toxigenic potential demonstrated that almost 80% of strains were able to produce mycotoxins,47% produced aflatoxins and 72% produced cyclopiazonic acid,alone or in combination with aflatoxin