Lymphocytes B et immunoglobulines néonatales dans un contexte d'infection parasitaire congénitale : stratégies méthodologiques de caractérisation

par Magalie Dambrun Dit Tambrun

Thèse de doctorat en Immunologie

Sous la direction de Florence Migot-Nabias.

Soutenue le 20-11-2018

à Sorbonne Paris Cité , dans le cadre de École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....) , en partenariat avec Université Paris Descartes (1970-2019) (établissement de préparation) et de Mère et enfant face aux infections tropicales / MERIT - UMR_D 216 (laboratoire) .


  • Résumé

    Durant ses premiers mois de vie, le nouveau-né a la particularité d'être protégé par les immunoglobulines (Ig)G de sa mère, qui sont transférées au cours de la grossesse, et sont présentes dans son sérum conjointement aux IgG qu'il néo-synthétise. La distinction dans un sérum de nouveau-né, entre les IgG d'origine maternelle et fœtale, est difficile à mettre en œuvre, mais peut s'avérer très utile pour contribuer à diagnostiquer de façon précoce certaines infections congénitales, notamment dans le cas d'infections parasitaires. À ces fins, notre groupe de travail a mis en place une méthodologie reposant sur la spectrométrie de masse et qui exploite des polymorphismes peptidiques individuels localisés sur les domaines constants CH2 et CH3-CHS de la chaîne lourde des IgG. Nous proposons dans ce travail de valider cette approche par biologie moléculaire. L'amplification et le séquençage spécifiques des domaines constants CH2 et CH3-CHS des 4 sous-classes d'IgG totales ont permis i/de valider l'approche par spectrométrie de masse bottom-up et ii/de mettre en évidence de nouveaux polymorphismes nucléotidiques entraînant ou non un changement en acide aminé. Cette approche exige une purification exclusive des IgG spécifiques de pathogène, qui peut être contournée en utilisant une autre approche, cellulaire, reposant sur les IgG spécifiques sécrétées par les lymphocytes (Ly) B du nouveau-né. Ainsi, les spécificités individuelle et antigénique de l'Ig sont conciliées. Pour ce faire, un autre développement de mon travail a consisté dans l'adaptation de la technique ELISPOT (Enzyme-Linked ImmunoSpot), dans le cadre de la toxoplasmose, causée par le parasite Toxoplasma gondii, et responsable avec la maladie de Chagas de la plupart des cas d'infections congénitales d'origine parasitaire. Les mises au point ont été faites avec des cellules mononucléées d'adultes volontaires séronégatifs et séropositifs pour la toxoplasmose, qui nous ont conduits à faire le choix d'un lysat parasitaire de T. gondii de type I comme candidat antigénique multi-épitopes par rapport à la protéine recombinante spécifique SAG1 (Surface Antigen 1), protéine membranaire représentative du parasite. L'exploration d'autres paramètres est nécessaire pour compléter l'adaptation de l'ELISPOT dans le cadre précis d'une infection parasitaire congénitale. Il s'agit notamment d'évaluer i/la pertinence du test lors d'une infection récente avec T. gondii, en utilisant des LyB d'adultes en séroconversion et/ou de nouveau-nés ayant contracté une toxoplasmose congénitale, et ii/ l'ubiquité du test, en étudiant sa capacité à révéler avec une même efficacité les IgG sécrétées par des LyB d'individus infectés par des souches de toxoplasme circulant dans des zones géographiques différentes. Pour rendre possible cette dernière phase d'adaptation de l'ELISPOT, la mise en place d'études de terrain s'est imposée afin de constituer une bio-banque dans le cadre de suivis de la toxoplasmose chez des femmes enceintes et leurs nouveau-nés à l'accouchement : une première étude a été réalisée pendant 3 mois en 2018 dans la maternité d'un CHU à Cotonou au Bénin ; parallèlement un essai clinique est en cours pour 18 mois depuis juin 2018 dans 3 maternités d'hôpitaux de l'AP-HP en Ile de France. En supplément, une étude séro-épidémiologique rétrospective de la toxoplasmose chez environ 1000 femmes enceintes au sud du Bénin, à partir de plasmas collectés dans un projet mené en 2008-2010 dans notre UMR, permettra de documenter pour la première fois sur un aussi large effectif, la séroprévalence de la toxoplasmose chez des femmes enceintes au Bénin (53%) ainsi que le taux de séroconversion toxoplasmique pendant la grossesse (en cours). En plus des objectifs énoncés, l'ensemble de ces travaux contribue à mieux documenter l'exploration du système immunitaire fœtal.

  • Titre traduit

    B cells and neonatal immunoglobulins in a context of parasitic congenital infection : methodological strategies of characterization


  • Résumé

    In the first months of life, the newborn is protected from infections by the maternal immunoglobulins (Ig) G, which are transferred during pregnancy, and are present in his serum together with his neo-synthesized IgG.The distinction in neonatal serum between maternal and fetal IgG is difficult to implement, but could be very useful for diagnosing congenital infections early, particularly in the case of parasitic infections. For this purpose, our team has established a methodology based on mass spectrometry that exploits individual peptide polymorphisms located on the CH2 and CH3-CHS domains from the constant IgG heavy chain. In this work, we propose to validate this approach by molecular biology. The specific amplification and sequencing of the CH2 and CH3-CHS constant domains of the 4 total IgG subclasses allowed i/to validate the bottom-up mass spectrometry approach and ii/to highlight new nucleotide polymorphisms causing or not an amino acid change. This approach requires an exclusive purification of pathogen-specific IgG, which can be circumvented using another cell-based approach, based on the specific IgG secreted by the newborn B lymphocytes (Ly). Thus, the individual and antigenic specificities of Ig are reconciled. To do this, another development of my work consisted in the adaptation of the ELISPOT technique (Enzyme-Linked ImmunoSpot), in the context of the toxoplasmosis, caused by Toxoplasma gondii parasite, and responsible with the Chagas disease of the most cases of congenital infections of parasitic origin. Developments were made with mononuclear cells from adult volunteers seronegative and seropositive for toxoplasmosis, which led us to select a parasitic T. gondii type I lysate as multi-epitopes antigenic candidate compared to the specific recombinant protein SAG1 (Surface Antigen 1), a membrane protein representative of the parasite. The investigation of other parameters is necessary to complete the ELISPOT adaptation in the specific context of congenital parasitic infection. These include assessing i/the suitability of the test in the case of a recent infection with T. gondii, using B Ly from seroconverting adults and/or neonates with congenital toxoplasmosis, and ii/the test ubiquity, by studying its ability to reveal with the same efficiency the IgG secreted by B Ly from individuals infected with toxoplasm strains circulating in different geographical areas. To make this last ELISPOT adaptation phase possible, the implementation of field studies was essential in order to constitute a bio-bank resulting from toxoplasmosis follow-ups of pregnant women and their newborns at childbirth: a first study was conducted for 3 months in 2018 in the CHU maternity in Cotonou, Benin; also, a clinical trial has been in progress for 18 months since June 2018 in 3 AP-HP hospitals maternities, in Ile de France. In addition, a retrospective sero-epidemiological study of toxoplasmosis in about 1000 pregnant women in southern Benin, was conducted, using plasma samples collected 2008-2010 in our unit. This will document for the first time toxoplasmosis seroprevalence on a wide effective of pregnant women in Benin (53%) as well as the rate of toxoplasmic seroconversion during pregnancy (ongoing). In addition to the stated objectives, all of this work contributes to better documenting the exploration of the fetal immune system.


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