Analyse moléculaire des cellules épithéliales mammaires humaines infectées par le cytomégalovirus humain

Molecular analysis of the human mammary epithelial cells infected by human cytomegalovirus.

• Auteur / Autrice : Fatima Al Moussawi
• Direction : Georges Herbein, Walid Karam, Mona Diab-Assaf
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de l'environnement. Médecine, microbiologie et maladies transmissibles
• Date : Soutenance le 26/10/2018
• Etablissement(s) : Bourgogne Franche-Comté en cotutelle avec Université Libanaise
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Environnements, Santé (Dijon ; Besançon ; 2012-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Agents pathogènes et inflammation (API) (Besançon) - Agents pathogènes et inflammation (API)
• Partenaire(s) de recherche : Site de préparation : Université de Franche-Comté
• Jury : Président / Présidente : Bertrand Liagre
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Georges Herbein, Walid Karam, Mona Diab-Assaf, Bertrand Liagre, Christian Schwartz, Hasan Zaraket, Raghida Aboumerhi
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Christian Schwartz, Hasan Zaraket

Mots clés

Mots clés contrôlés

Électrophorèse

Génome humain

Transcriptome

Cellules épithéliales

Cancer du sein

Génétique virale

Infections à cytomégalovirus

Mots clés libres

Cytomegalovirus

Cancer du sein

Hmec

Transcriptome

Génome

Cytomegalovirus

Breast cancer

Hmec

Transcriptome

Genome

Résumé

Depuis plusieurs années, le rôle joué par le cytomégalovirus humain (HCMV) dans le développement des maladies inflammatoires et du cancer a été étudié par plusieurs groupes de recherche. Divers tissus tumoraux, notamment dans le cancer du colon, du foie, de la prostate, du cerveau (glioblastome, médulloblastome) et du sein, ont montré la présence d’antigènes ou d’ADN du HCMV. Cette accumulation de preuves de l'implication de l'infection par le HCMV dans les maladies malignes de diverses entités cancéreuses a conduit au développement du concept d'«oncomodulation», qui est expliqué par la capacité du HCMV à contribuer au processus d’oncogenèse, sans toutefois aucun potentiel de transformation directe. HCMV-DB (KT959235) est un isolat clinique provenant d'un échantillon de col de l'utérus d'une femme enceinte de 30 ans, préalablement isolé dans notre laboratoire. Cette souche virale a montré sa capacité à infecter les macrophages primaires et a montré une réplication productive dans les cellules épithéliales mammaires humaines (HMECs). Les HMECs infectées entraînaient l’établissement d’un environnement cellulaire pro-oncogène avec une hyperphosphorylation de Rb et une activité fonctionnelle réduite de p53, une régulation positive de c-Myc, une surexpression de l'activité télomérase et de STAT3, et une régulation positive de la cycline D1, provoquant une prolifération cellulaire accrue. En outre, HCMV-DB a montré son potentiel pour transformer les HMECs primaires par test de formation de colonies sur gélose molle, un test connu pour l’observation de la transformation cellulaire. De manière intéressante, les HMECs infectées par HCMV-DB en culture ont montré l’émergence d’amas de cellules sphéroïdes, qui ont été désignées cellules CTH (HMECs transformées par le CMV). Dans notre thèse, nous avons caractérisé le profil génomique de la souche HCMV-DB et nous l’avons comparé à des souches soit cliniques soit de laboratoire. HCMV-DB a été caractérisée comme proche des génomes des souches Toledo et JP, et cette dernière est une souche clinique isolée à partir d’un tissu glandulaire, la prostate. Nous avons également comparé les gènes impliqués dans l’entrée virale par des analyses phylogénétiques et nous avons observé la proximité de HCMV-DB avec la souche prototypique du HCMV, Merlin. En étudiant le profil transcriptomique des HMECs infectées par HCMV-DB, nous avons trouvé qu’elles présentent un phénotype basal-like triple négatif, ER-/PR-/HER2-, ainsi que des caractéristiques oncogéniques, incluant une up-régulation de l’expression de plusieurs oncogènes, de gènes pro-survie (avec down-régulation de la caspase 8), et de marqueurs de la prolifération, du caractère souche des cellules et de la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT). Le profil transcriptomique des HMECs infectées par HCMV-DB a également montré des modifications variées dans la signalisation cellulaire, l’angiogenèse et la protéolyse. Au niveau de la chromatine, les HMECs inféctées par HCMV-DB ont révélé une hypométhylation globale. En cherchant la présence du génome de HCMV-DB dans les cellules CTH formées, nous avons détecté une signature du génome de HCMV-DB, à savoir le lncRNA4.9. Globalement, nos données ont montré que le transcriptome des HMECs infectées par HCMV-DB révèle clairement des traits pro-oncogéniques et la détection d’une partie du génome de HCMV-DB suggère que cette partie du génome viral peut être responsable de la transformation cellulaire obtenue.

Since several years, the role played by human cytomegalovirus (HCMV) in the development of inflammatory diseases and cancer has been extensively studied and addressed by different research groups. Various tumor tissues originating from colon, liver, prostate, brain (glioblastoma, medulloblastoma) and breast cancer have shown to harbor either the antigen or the DNA of HCMV. These growing evidences about the implication of HCMV infection in malignant entities had led to the emergence of the concept of “Oncomodulation”. This is explained by the ability of the virus to contribute to the oncogenic processes, however without any direct transformatory potential. HCMV-DB (KT959235) is a clinical isolate obtained from a cervical swab specimen of a 30-year-old pregnant woman previously isolated in our laboratory. This viral strain had shown its ability to infect the primary macrophages and to replicate productively in the human mammary epithelial cells (HMECs). In fact, HMECs infected by HCMV-DB resulted in the establishment of a pro-oncogenic cellular environment characterized by retinoblastoma (Rb) hyperphosphorylation and a decreased p53 functional activity, enhanced telomerase activity, upregulation of c-Myc, activation of Akt and STAT3, and upregulation of cyclin D1 causing an enhanced cellular proliferation. Furthermore, HCMV-DB had shown its potential to transform the primary HMECs by colony formation on soft agar, a well know assay to perceive transformation. Interestingly, HCMV-DB infected HMECs in culture showed the emergence of clusters of spheroid cells that were named CTH cells (CMV Transformed HMECs). In our thesis we characterized the genomic profile of HCMV-DB strain and compared it to either clinical or laboratory strains. HCMV-DB was shown to be close to the genomes of Toledo and JP strains where the JP strain is a clinical strain that was isolated from a glandular tissue, the prostate. We also compared the genes that are involved in virus entry using phylogenetic analyses and we observed that HCMV-DB is close to the prototypic HCMV strain, Merlin. By studying the transcriptomic profile of HMECs infected with HCMV-DB, we found that it displays a triple negative basal-like phenotype, ER−/PR−/HER2−, and presents oncogenic characteristics with upregulated expression of several oncogenes, pro-survival genes (with a down-regulation of caspase 8), proliferation markers, stemcellness and epithelial mesenchymal transition (EMT). The transcriptomic profile of HMECs infected with HCMV-DB also displays variant modifications in cell signaling, angiogenesis and proteolysis. At the chromatin level, HMECs infected with HCMV-DB reveals a global hypomethylation state. By screening for the presence of HCMV-DB genome in the formed CTH cells, we detected a signature of the HCMV-DB genome, namely a lncRNA4.9. Taken together, our data showed that the transcriptome of HMECs infected with HCMV-DB clearly reveals a pro-oncogenic traits and the detection of part of the HCMV-DB genome suggests that this part of the viral genome might be responsible for the obtained cellular transformation.