In vitro study of membrane remodeling and curvature sensing at the micrometric scale by budding yeast septins

par Alexandre Beber

Thèse de doctorat en Biophysique

Sous la direction de Stéphanie Mangenot et de Aurélie Bertin.

Soutenue le 23-11-2018

à Sorbonne université , dans le cadre de École doctorale Physique en Île-de-France (Paris ; 2014-....) , en partenariat avec Unité physico-chimie Curie (Paris) (laboratoire) .

Le président du jury était Sophie Cribier.

Le jury était composé de Antoine Jegou.

Les rapporteurs étaient Manouk Abkarian, Gijsje Koenderink.

  • Titre traduit

    Étude in vitro du remodelage de la membrane et de la sensibilité à la courbure à l'échelle micrométrique par les septines de levure bourgeonnante


  • Résumé

    Les septines constituent une nouvelle classe de protéines du cytosquelette. Les septines de levure s’auto-assemblent en filaments non-polaires liés à la face interne de la membrane plasmique à travers des interactions spécifiques avec le L- α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2. Les septines sont localisées au niveau de sites de constriction durant la cytokinèse et ont un impact sur le remodelage de la membrane. Nous avons utilisé une plage d’outils biomimétiques in vitro pour examiner comment les septines de levure se comportent sur des membranes courbées et déformables. Des tests in vitro utilisant des Vesicules Unilamellaires Géantes (GUVs) sont des outils pertinents pour obtenir des informations sur l’interaction protéine-lipide, la mécanique de membrane et la sensibilité à la courbure. Obtenir des GUVs dopées au PI(4,5)P2 peut être difficile. Nous avons d’abord optimisé l’incorporation de PI(4,5)P2 dans des GUVs en étudiant l’interaction entre les septines et les GUVs. Nous montrons que cette interaction est plus spécifique qu’en utilisant un rapporteur usuel (phospholipase C1). Nous avons montré que l’électro-formation sur fils de platines est la méthode la plus appropriée pour atteindre une interaction septines- lipides optimale. De plus, nous avons montré que les GUVs contenant du PI(4,5)P2 doivent être utilisées quelques heures après leur préparation. En effet, avec le temps, le PI(4,5)P2 est éjecté de la membrane des GUVs et la concentration de PI(4,5)P2 dans la bicouche diminue. Ensuite, nous avons analysé comment les septins peuvent contrôler les propriétés mécaniques de la membrane et analysé comment les déformations de la membrane pouvaient être induites par la sensibilité des septines à des courbures spécifiques. En effet, nous avons montré que les septines reforment la membrane de GUVs avec l’apparition de piques périodiques. Nous avons montré que ces déformations sont associées à la préférence de courbure des filaments de septine. En se liant à des bicouches supportées posées sur des substrats possédant un motif ondulé présentant des courbures positives et négatives, les filaments de septine restent droits et perpendiculares à la courbure aux endroits convexes et se plient négativement pour suivre les géométries concaves. En se basant sur ces résultats, nous proposons un modèle théorique qui décrit quantitativement les déformations et la sensibilité à la courbure micrométrique observée in vitro. Le modèle capture la réorganisation des filaments de septines durant la cytokinèse in vivo, fournissant des informations sur la mécanique de la division cellulaire.


  • Résumé

    Septins constitute a novel class of cytoskeletal proteins. Budding yeast septins self-assemble into non-polar filaments bound to the inner plasma membrane through specific interactions with L- α-phosphatidylinositol-4,5- bisphosphate (PI(4,5)P2). Septins localize at constriction sites during cytokinesis and impact membrane remodeling processes. We have analyzed a range of in vitro biomimetic tools to examine how yeast septins behave on curved and deformable membranes. In vitro assays using Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are relevant tools to reveal insights in proteins-lipids interactions, membrane mechanics and curvature sensitivity. GUVs doped with PI(4,5)P2 are challenging to prepare. We first optimized the incorporation of PI(4,5)P2 lipids into GUVs by probing the proteins-PI(4,5)P2 GUVs interactions. We show that the interaction between budding yeast septins and PI(4,5)P2 is more specific than using usual reporters (phospholipase C1). We have shown that electro-formation on platinum wires is the most appropriate method to achieve an optimal septin-lipid interaction. Besides, we have shown that PI(4,5)P2 GUVs have to be used within a few hours after their preparation. Indeed, over time, PI(4,5)P2 is expelled from the GUV membrane and the PI(4,5)P2 concentration in the bilayer decreases. Next, we analyzed how septins can control the mechanical properties of membranes and analyzed how membrane deformations could be induced by a specific curvature sensitivity of septins. Indeed, we have shown that septins reshape the membranes of Giant Unilamellar Vesicles with the formation of periodic spikes. We have shown that membrane deformations are associated to septin filament curvature arrangement preferences. When binding to bilayers supported on custom-designed periodic wavy patterns displaying positive and negative micrometric radii of curvatures, septin filaments remain straight and perpendicular to the curvature of the convex parts, while bending negatively to follow concave geometries. Based on these results, we propose a theoretical model that quantitatively describes the deformations and micrometric curvature sensitivity observed in vitro. The model captures the reorganizations of septin filaments throughout cytokinesis in vivo, providing mechanistic insights into cell division.


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