étude structurale et fonctionnelle de la protéine a1 du bactériophage t5 : une dnase octamérique originale

structural and functional study of bacteriophage t5 a1 protein : an original octameric dnase

• Auteur / Autrice : Léo Zangelmi
• Direction : Pascale Boulanger
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie et biologie structurale
• Date : Soutenance le 06/12/2018
• Etablissement(s) : Université Paris-Saclay (ComUE)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Innovation thérapeutique : du fondamental à l'appliqué (Châtenay-Malabry, Hauts-de-Seine ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Université Paris-Sud (1970-2019)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de biologie intégrative de la cellule (Gif-Sur-Yvette, Essonne ; 2015-....)
• Jury : Président / Présidente : Stéphanie Bury-Moné
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Stéphanie Bury-Moné, Laurent Debarbieux, Wim Burmeister, François Lecointe
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Laurent Debarbieux, Wim Burmeister

Mots clés

Mots clés contrôlés

Nucléases

Structure atomique

Siphoviridés

Cryomicroscopie

Mots clés libres

Bactériophage T5

Dnase

Exonucléase

Structure

Cryomicroscopie électronique

Saxs

Bacteriophage T5

DNase

Exonuclease

Structure

Cryo Electron Microscopy

Saxs

Résumé

Les bactériophages neutralisent les systèmes de défense et détournent les fonctions vitales de leur hôte pour favoriser leur multiplication. Les gènes de phages qui gouvernent cette prise de contrôle de l’hôte restent mal connus, pourtant leur caractérisation présente un intérêt majeur pour mettre à jour des fonctions bactériennes spécifiquement ciblées par les phages et pour concevoir de nouveaux agents antibactériens.Le phage T5 injecte son ADN dans la bactérie Escherichia coli en deux étapes. Seuls les gènes précoces codés par 8% du génome entrent dans la cellule et le transfert s’arrête. Leur expression induit la dégradation du chromosome de l’hôte et l’inactivation de ses systèmes de restriction et de réparation de l’ADN. Après quelques minutes, le reste de la molécule d’ADN est injecté, ce qui permet la production de nouveaux phages. Deux gènes précoces A1 et A2 ont été identifiés comme essentiels pour la reprise du transfert de l’ADN et A1 est également nécessaire pour induire la dégradation de l’ADN de l’hôte. A1 et A2 sont les deux seuls gènes connus pour être impliqués dans la régulation de ce système original d’infection, mais leur fonction n’a jamais été identifiée.Ma thèse porte sur la caractérisation fonctionnelle et structurale des protéines A1 et A2. J’ai purifié A1 et démontré in vitro qu’elle avait une activité DNase dépendante du manganèse. Sa structure atomique a été résolue par cryomicroscopie électronique à 3.01 Å de résolution, montrant une organisation octamérique de symétrie D4 inédite pour une DNase. Chaque monomère (61kDa) contient un domaine exonuclease dont le site actif lie deux ions Mn2+ et qui s’apparente au site catalytique des domaines exonucléases de la DNA polymerase II et des DNAses associées aux systèmes de recombinaison homologue et de réparation de l’ADN comme Mre11. En construisant différents mutants de A1, j’ai identifié certains acides aminés essentiels pour l’activité catalytique et, par des expériences de complémentation fonctionnelle, j’ai montré que cette activité était indispensable pour l’infection. L’ensemble de ces résultats suggèrent que A1 est la DNase, jusqu’ici inconnue, responsable de la dégradation massive du génome de l’hôte au tout début de l’infection. Enfin, j’ai observé que la production de A1 pendant l’infection induit une forte activité recombinase. De nombreux autres bactériophages qui n’appartiennent pas à la famille des T5virus produisent également une protéine similaire à A1 dont la fonction n’a jamais été identifiée. Ce travail est un premier pas vers la compréhension de son rôle dans le mécanisme général d‘infection par les phages. Une deuxième partie de cette thèse porte sur la caractérisation structurale de A2. Des recherches de similarité indiquent la présence d’un domaine Helix-Turn-Helix typique des régulateurs transcriptionnels. J’ai purifié A2 et montré que cette protéine de 14 kDa est un dimère en solution. La caractérisation des propriétés biochimiques de A2 a permis de débuter l’étude de sa structure par RMN.Les résultats de ma thèse ont révélé la structure originale d’une DNase de bactériophage qui contrôle la dégradation du génome bactérien et la régulation du transport de l’ADN viral au début du cycle infectieux. Ces résultats soulèvent des questions intrigantes : comment l’ADN de T5 est-il protégé de l’activité DNase de A1 ? Comment A1 et A2 interagissent-elles lors des étapes de prise de contrôle de l’hôte ?

Bacteriophages defeat bacterial defences and hijack host cell machineries to establish a favourable environment for their multiplication. Early-expressed viral genes that govern host takeover are highly diverse from one phage to another and most of them have no assigned function. They thus represent a pool of novel genes whose products potentially subvert bacterial cell vital functions and could help in designing new antibacterial strategies.T5 phage uses a unique 2-step mechanism to deliver its DNA into its host Escherichia coli. At the onset of the infection, only 8 % of the genome enter the cell before the transfer temporarily stops. Expression of the genes encoded by this DNA portion leads to host chromosome degradation and inactivation of host restriction and DNA mending systems. After a few minutes, T5 DNA transfer resumes, allowing further phage multiplication. A1 and A2 are early genes required for DNA transfer completion and A1 is also necessary to trigger host DNA degradation. A1 and A2 are the only two genes known to be involved in the regulation of this original infection system, but their function yet remains to be characterized.The objectives of this work were to characterize the function and structure of A1 and A2 proteins. I have purified the A1 protein and shown that it has a manganese-dependent DNase activity in vitro. Cryo Electron Microscopy at 3.01 Å resolution unravelled its structure, showing an octameric organization with a D4 symmetry, which is unprecedented for a DNase. Each monomer (61 kDa) carries an exonuclease domain harbouring an active site with two Mn2+ ions. This site is similar to those from the exonuclease domain of the DNA polymerase II and from DNases involved in DNA mending and recombination events like Mre11. I identified essential catalytic residues for the DNase activity and demonstrated that this activity is crucial for infection by engineering A1 mutant proteins and by doing functional complementation assays. Taken together, my results suggest that A1 could then be the elusive DNase responsible for the massive host genome degradation observed during T5 phage infection. Eventually, I uncovered a recombinase activity associated to A1 production during infection. Similar proteins to A1 with unknown functions are produced in several other bacteriophages outside of the T5virus family. This work is a first step towards understanding the role of this protein in the general mechanism of infection by bacteriophages. In a second part, I worked on the structural characterisation of A2 protein. Similarity searches revealed a helix-turn-helix domain typically found in transcriptional regulators. I purified and demonstrated the dimeric organisation of this 14-kDa protein in solution. This initial characterization of A2 has opened avenues for further NMR studies.During my Ph.D., I uncovered the structure of an original bacteriophage DNase that controls bacterial genome degradation and that regulates viral DNA transport at the beginning of the infectious cycle. These results open the intriguing question about the mechanism for T5 DNA protection from A1 DNase activity as well as about the interplay between A1 and A2 during the host takeover.