Développement et caractérisation de modèles vitro et vivo de cancers pédiatriques infiltrant du tronc cérébral (DIPG)

Development and Characterization of Vitro and Vivo Models of DIPG for the Study of Tumor Progression

• Auteur / Autrice : Alexandre Plessier
• Direction : Jacques Grill, David Castel
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
• Date : Soutenance le 05/10/2018
• Etablissement(s) : Université Paris-Saclay (ComUE)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Cancérologie : biologie-médecine-santé (Villejuif, Val-de-Marne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Vectorologie et thérapeutiques anti-cancéreuses (Villejuif, Val-de-Marne ; 2010-2019)
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Université Paris-Sud (1970-2019)
• Jury : Président / Présidente : Pascale Aubry épouse Varlet
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Jacques Grill, David Castel, Pascale Aubry épouse Varlet, Ahmed Idbaih, Eric Chevet, Chris Jones
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Ahmed Idbaih, Eric Chevet

Mots clés

Mots clés contrôlés

Gliomes

Cancer

Histones

Mots clés libres

Dipg

Pédiatrique

Cancer

Mutation Histone

H3-K27m

Dipg

Pediatric

Cancer

Histone mutation

H3-K27m

Résumé

Les gliomes infiltrants du tronc cérébral (DIPG) sont les gliomes pédiatriques les plus agressifs. Leur localisation dans le pont de Varole et leur caractère infiltrant les rendent inopérables. Le manque de matériel biologique et l’absence de modèles pertinents ont longtemps freiné le développement de nouvelles thérapies. Le séquençage du génome entier de ces tumeurs a identifié la substitution K27M des gènes d’histone HIST1H3B/C et H3F3A comme mutation somatique initiatrice des DIPG. Bien que partageant la mutation sur le même résidu, notre laboratoire a montré que les tumeurs mutées dans le gène codant H3.1 ou H3.3 définissent des sous-groupes de DIPG avec des programmes oncogéniques, propriétés d’invasion et survies différents.Dans ce contexte, le premier objectif de ma thèse a consisté à développer des modèles in vitro et in vivo pertinents de la maladie. Pour ce faire, nous avons dissocié des biopsies fraiches de DIPG naïves de tout traitement et avons, de manière systématique, mis en culture une moitié de la suspension dans du milieu sans sérum pour permettre l’expansion de cellules souches de gliomes (GSC). En parallèle, l’autre moitié a été directement injectée par stéréotaxie dans le cerveau de souris immunodéprimées, pour obtenir des modèles de xénogreffes dérivés de patients (PDX). De plus, nous avons obtenu un second type de modèle in vivo de DIPG à partir des cellules tumorales en culture greffées dans le tronc par stéréotaxie (CDX). Au préalable, les GSC ont été modifiées pour exprimer de manière stable la protéine fluorescente mKate2 et l’enzyme Luciférase, permettant le suivi longitudinal de la croissance tumorale. Nous avons pu générer des GSCs issues de 26 patients différents mutées dans le gène codant H3.1 ou H3.3 et qui maintiennent leurs propriétés de cellules souches in vitro. De plus, nous avons généré 8 modèles PDX et 6 modèles CDX développant des tumeurs infiltrantes et présentant les mêmes symptômes neurologiques que les patients. Conformément aux données cliniques, nos modèles in vivo mutés H3.3 ont développé des tumeurs infiltrant le parenchyme plus rapidement que les modèles H3.1. En somme, ces résultats indiquent que nous avons réussi à générer des modèles de DIPG à partir d’échantillons naïfs de tout traitement, et qui récapitulent les aspects cliniques et moléculaires de ce cancer.Nous avons ensuite profité des modèles GSCs pour étudier les mécanismes moléculaires qui conduisent au phénotype invasif. Dans un premier temps, nous avons montré que l’expression de CXCR4, un récepteur de chimiokines, est corrélée à la capacité migratoire des GSC in vitro. Cependant, l’inhibition de CXCR4 par un antagoniste n’a montré d’efficacité que dans une partie des GSC testées, suggérant l’implication d’autres voies de signalisations dans leur motilité. Aussi, dans le but d’identifier de manière non biaisée de nouveaux mécanismes moléculaires impliqués dans la migration des GSC, nous avons analysé le profil transcriptomique de 13 GSC présentant une mutation K27M dans les gènes codant H3.1 ou H3.3 par séquençage de l’ARN. Nous avons ensuite sélectionné les gènes dont le niveau d’expression était corrélé à la vitesse de migration des différentes GSCs. Ainsi, nous avons découvert plusieurs candidats, parmi lesquels CXCL10, le ligand du récepteur aux chimiokines CXCR3, et SPSB4, une ubiquitine-ligase, qui sont surexprimés dans les tumeurs migrant rapidement. L’implication de ces 2 gènes dans la migration sera étudiée in vitro et in vivo dans des expériences de perte de fonction en utilisant des constructions exprimant des shARN inductibles.Au total, ce travail a permis le développement de modèles pertinents de DIPG qui récapitulent les caractéristiques de la tumeur dont ils dérivent et qui reflètent l’hétérogénéité interindividuelle observée chez les patients. De plus, cette étude a permis la découverte de nouveaux mécanismes moléculaires qui favorisent la migration de ces cellules tumorales très particulières.

Diffuse Instrincic Pontine Gliomas (DIPG) are the most aggressive form of pediatric gliomas. They are infiltrative tumors originating from the brainstem. The lack of biological material and the absence of relevant models have for long hampered the development of new therapeutics. Whole genome sequencing of tumor DNA identified a K27M substitution in the histone genes HIST1H3B/C and H3F3A as a recurrent somatic driver mutation in DIPG. Despite sharing the mutation on the same residue, our lab demonstrated that H3.1- and H3.3-mutated tumors define distinct subgroups of DIPG with different oncogenic programs, overall survival or invasion properties.Thus, the first goal of my PhD project consisted in developing relevant in vitro and in vivo models from treatment-naive primary specimen of DIPG that would mimic the disease. To do so, our strategy has been to dissociate fresh biopsies upon reception from the operating room and systematically place one-half of the cell suspension in serum-free culture to allow the expansion of Glioma Stem-like cells (GSCs) while the other half is directly stereotactically injected into the brain of Nude mice to develop Patient-derived xenograft models (PDX). We also obtained a second type of in vivo DIPG models, Cell-derived Xenograft models (CDX), after stereotactic xenografting of GSCs. Cells were modified beforehand to stably express a fluorescent protein as well as the Firefly luciferase enzyme, thus allowing the longitudinal record of tumor growth. We succeeded in generating GSCs from 26 different patients harboring a K27M mutation either in H3.1 or H3.3, that maintained stemness properties in culture. In addition, we generated 8 PDX and 6 CDX models that developed infiltrative tumors with maintenance of DIPG hallmarks. All tumor-bearing mice displayed neurological disorders like impaired walking and/or hemi-paralysis, as observed in patients. In accordance with the clinical data, our H3.3-K27M in vivo models developed tumors faster than H3.1-K27M, as well as they infiltrate the parenchyma faster and deeper than H3.1-K27M models. Taken together, these results showed that we succeeded in generating models of DIPG from treatment-naïve samples that mimic the clinical and molecular aspects of the disease.We then took advantage of such GSCs models to decipher the molecular mechanisms driving the invasive phenotype of patients with DIPG. First, we showed that CXCR4 expression, a chemokine receptor, is correlated with the in vitro migration capacity of our cellular models of DIPG. However, inhibition using CXCR4-antagonist CXCR4 was only efficient in a subset of our models, suggesting that other signaling pathways could be involved in their motility. To further identify the molecular mechanisms involved in migration of GSCs in vitro in an unbiased manner, we profiled the transcriptome of 13 GSCs harboring both H3.1- and H3.3-K27M genotype by RNA-sequencing. We then selected genes which expression levels correlated with the migration speed of the different GSCs. We uncovered several candidates among which CXCL10, the ligand of the chemokine receptor CXCR3, and SPSB4, an ubiquitin-ligase, up-regulated in highly migrating tumor cells. The involvement of these 2 genes in migration will be investigated in vitro and in vivo in loss of function experiments using doxycycline-inducible shRNA expressing constructs.Altogether, this work allowed for the development of pertinent DIPG models that resemble the primary tumors they derive from and also reflect the inter-individual heterogeneity observed in patients. Additionally, we gained new insights on the molecular mechanisms promoting cell migration in these particular cells.