Paysage adaptatif des bêta-lactamases TEM-1 et CTX-M-15

Adaptative landscape of beta-lactamases TEM-1 and CTX-M-15

• Auteur / Autrice : André Birgy
• Direction : Olivier Tenaillon, Hervé Jacquier
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé. Microbiologie
• Date : Soutenance le 25/09/2017
• Etablissement(s) : Sorbonne Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Infection, anti-microbien, modélisation, évolution (Paris)
• Partenaire(s) de recherche : établissement de préparation : Université Paris Diderot - Paris 7 (1970-2019)
• Jury : Président / Présidente : Stéphane Bonacorsi
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Olivier Tenaillon, Hervé Jacquier, Stéphane Bonacorsi, Aleksandra Walczak, Isabel Gordo, Ivan Matic, Alexandra Aubry, Étienne Carbonnelle
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Aleksandra Walczak, Isabel Gordo

Mots clés

Mots clés contrôlés

biosynthèse

génétique

bêta-Lactamases

Évolution moléculaire

Épistasie

Résistance aux antibiotiques

Mots clés libres

Mutations compensatrices

Distribution de l'effet des mutations

Compensatory mutations

Distribution of the effect of mutations

Résumé

De part leur importance médicale, leur capacité à évoluer et leur facilité de manipulations, les bêta-lactamases TEM-1 et plus récemment CTX-M-15, se sont imposées comme des modèles de biochimie mais aussi des modèles pour une étude évolutive des protéines. La caractérisation de la distribution de l'effet des mutations dans une protéine permet d'avancer dans la compréhension des mécanismes moléculaires et des contraintes influant sur l'évolution des gènes de résistance aux antibiotiques et de façon plus globale sur les protéines.Par une approche de mutagénèse exhaustive suivie d’une évolution expérimentale sous sélection antibiotique couplée à du séquençage à haut débit, nous avons pu déterminer et décrire la distribution des effets des mutations dans la protéine TEM-1. Trois catégories de mutants ont été identifiées comme ayant des comportements différents en termes de cinétique de mort face à l'antibiotique. Des études phénotypiques ont permis de proposer un scénario impliquant une saturation progressive des principales protéines liant la pénicilline en fonction de l’activité hydrolytique du mutant de bêta-lactamase. Enfin, un modèle biochimique qualitatif compatible avec cette cinétique est proposé. La comparaison des effets des mutations entre TEM-1 et CTX-M-15, deux bêta-lactamases de la famille des sérines protéases de classe A et homologue à 30%, permet d’étudier la notion de contexte-dépendance des mutations. Notamment, à travers le résidu 251 qui est différent entre ces 2 protéines et intolérant aux mutations, nous replaçons cette problématique dans une perspective évolutive globale. Cela nous permet d’étudier les incompatibilités mutationnelles au sein des protéines et les possibilités de compensation des sites destabilisés. Nous observons une compensation à la fois globale, au travers de l’effet sur la stabilité, mais aussi locale avec une épistasie forte entre le résidu 251 et le site compensateur. Enfin, afin d’étudier de façon exhaustive les intéractions épistatiques dans les protéines, nous nous sommes focalisés sur une hélice alpha de la protéine TEM-1. L’étude de près de 73% des 22000 combinaisons mutationnelles possibles a permis de souligner l’importance de la stabilité thermodynamique, celle-ci expliquant une grande part des effets des mutations. Cependant, un contingent d’interactions ne semble pas expliquable par ce modèle ce qui montre l’importance des interactions locales au sein des hélices. Le couplage de ces approches évolutives quantitatives et mécanistiques permettent à la fois d’avancer dans la compréhension des contraintes qui sous-tendent l’évolution des protéines mais aussi de plonger au cœur de la résistance aux antibiotiques et de ses mécanismes moléculaires.

Beta-lactamases TEM-1 and more recently CTX-M-15 are antibiotic resistance enzymes that combine a medical importance, a fast evolution in the wild and are easy amenable to manipulation in the laboratory. As such, they have become models of biochemistry and also models for the study of protein evolution. The characterization of the distribution of mutational effect within a protein shed light on the molecular mechanisms and the constraints influencing the evolution of proteins.Using an exhaustive mutagenesis approach followed by an experimental evolution under antibiotic selection coupled with high-throughput sequencing, we were able to determine and describe the distribution of the effects of mutations in the TEM-1 protein. Three categories of mutants have been identified as having different behaviors in terms of survival kinetics when facing the antibiotic. Phenotypic studies have allowed us to propose a scenario involving a progressive saturation of the main penicillin-binding proteins as a function of the hydrolytic activity of the beta-lactamase mutant. Finally, a qualitative biochemical model compatible with this kinetic is proposed.I then compared the fitness effects of mutations in TEM-1 and CTX-M-15, which are two beta-lactamases of the class A serine protease family with 30% homology. I focused on the context dependency of mutation effects and concentrated my analysis on residue 251, which harbor a different aminoacid in each of the enzyme that is not functional when inserted in the other protein. I further studied how mutations in the rest of the protein could compensate that incompatibility. Compenstation was found to be associated to mutations acting presumably through on overall effect on protein stability, and on some cases to some local interactions with residue 251.Finally, in order to study exhaustively the epistatic interactions in proteins, we focused one alpha helix of TEM-1. The study of nearly 73% of the 22,000 possible mutational combinations made it possible to underline the importance of thermodynamic stability, which explains a large part of the effects of mutations. However, a contingent of interactions does not seem to be explained by this model, which shows the importance of the local interactions within the helices.The coupling of these quantitative and mechanistic evolutive approaches makes it possible both to advance in understanding the constraints underlying the evolution of proteins but also to plunge into the heart of resistance to antibiotics and its molecular mechanisms.