Controlling surface mediated insulin aggregation by peptides and light
Contrôler l'agrégation de l'insuline à la surface des matériaux via des interactions avec des peptides et la lumière
Résumé
The folding and stability of proteins depend on the physico-chemical conditions of their environment. Especially pH, temperature, stirring and interactions with other macromolecules or with interfaces (liquid-material surfaces; air-liquid; etc.) are known to induce protein denaturation and aggregation phenomena.The control of therapeutic protein stability represents a medical and economic challenge for the pharmaceutic industry. For instance insulin, which is the most s model produced therapeutic protein, is known to form amyloid aggregates in vitro induced by hydrophobic surfaces. Amyloid aggregates are also involved in several pathologies including human and animal diseases of high economic and public health impact.This thesis focuses on amyloid aggregation at material surfaces using insulin as a model protein. Previous work from our team have demonstrated that short peptides have the ability to significantly interfere with the kinetics of surface-driven amyloid aggregation and this at sub-stoichiometric concentrations with respect to insulin. In particular peptides adopting a beta-sheet secondary structure when adsorbed on hydrophobic surfaces, were able to reduce the nucleation time of insulin aggregation.In the present work we have discovered peptide sequences presenting, again at sub-stoichiometric concentrations, two antagonistic effects on insulin aggregation kinetics. The first consists in a cooperative reduction of the nucleation time and operates via peptides bound to the material surface. The second, on the other hand, results in a powerful inhibition of both nucleation and fiber elongation via peptides remaining in solution.We have first quantitatively characterized these effects on a set of peptides presenting alternate primary sequences of the type (LK)nL, and investigated the underlying mechanisms promoting insulin nucleation. Quantitative fluorescence measurements (Thioflavin T, fluorescent labelling of the peptide) have shown that the cooperative adsorption of peptides on hydrophobic material surfaces was responsible for the reduction of the insulin nucleation time. We have then shown that the inhibitory effect results from the binding of peptides in solution to fibrillar insulin aggregates and that this effect is mediated by charges.In addition we studied the localization of the insulin nucleation and of the appearance of the first aggregates using fluorescence microscopy. We observed the preferential appearance of the first ThT positive aggregates at the solid-liquid-air triple interface undergoing high shear stress, making these regions the predominant nucleation sites.We eventually developed a technique allowing a localized and patterned growth of light-induced insulin aggregates on glass surfaces. This atypical aggregation pathway does not present any observable lag time and depends strictly on Thioflavin T. We have shown that the ThT inserted between the cross beta-sheets and which can be excited at 440 nm locally provides the energy required for the conformational transition of the native insulin into the aggregated one. This method can be used to obtain a differential amyloid growth between surface area of different hydrophobicity.
Le repliement et la stabilité des protéines dépendent des conditions physico-chimiques de leur environnement. En particulier, le pH, la température, l’agitation et les interactions avec d’autres macromolécules ou avec les interfaces (liquide–surfaces des matériaux ; air-liquide ; etc.) sont connues pour induire des phénomènes de dénaturation et d’agrégation des protéines.Le contrôle de la stabilité des protéines thérapeutiques représente un enjeu médical et économique pour l’industrie pharmaceutique. L’insuline, qui est la protéine thérapeutique la plus produite, est connue in vitro pour former des fibres amyloïdes induites par les surfaces hydrophobes. Les agrégations amyloïdes sont également impliquées dans un certain nombre de pathologies, notamment humaines et animales présentant de forts enjeux de santé publique et économiques.Cette thèse traite en particulier de l’agrégation amyloïde à la surface des matériaux en utilisant l’insuline comme protéine modèle. Les travaux précédents réalisés par notre équipe ont démontré que des peptides de courte longueur avaient la capacité de modifier très significativement la cinétique d’agrégation induite par la surface des matériaux, et ce à des concentrations sub-stœchiométriques par rapport à l'insuline. En particulier les peptides adoptant une conformation secondaire en feuillet beta une fois adsorbés sur les surfaces hydrophobes, induisent une réduction drastique de la durée de nucléation de fibres amyloïdes d’insuline.Dans les travaux présentés ici nous avons découvert des séquences peptidiques présentant, toujours à des concentrations sub-stœchiométriques, deux effets antagonistes sur la cinétique de l’agrégation amyloïde de l’insuline. Le premier effet, coopératif et localisé à la surface de matériaux hydrophobes, résulte en une accélération de la nucléation. A l’inverse le second effet provient des peptides en solution et résulte en une puissante inhibition à la fois de la nucléation et de l’élongation des fibres.Nous avons premièrement caractérisé quantitativement ces effets pour un ensemble de peptides possédant des séquences de type (LK)nL, et investigué les mécanismes à l’origine du phénomène accélérateur. Des mesures quantitatives de fluorescence (Thioflavine T, marquage fluorescent du peptide) ont permis de montrer que l’adsorption coopérative des peptides sur la surface du matériau était responsable de l’accélération de la vitesse de nucléation. Pour l’effet inhibiteur, provenant des peptides en solution, nous avons démontré que cet effet résulte de la liaison des peptides sur l’insuline fibrillaire et qu’il est médié par les charge.De surcroit nous avons étudié la localisation de la nucléation et de l’apparition des premiers agrégats par microscopie à fluorescence. Nous avons observé que les zones situées à l’interface triple matériau-air-solution et subissant une contrainte de cisaillement élevé étaient les sites préférentiels d’apparition des premiers agrégats amyloïdes et donc très probablement les régions dominantes en termes de nucléation.Nous avons enfin développé une technique permettant une croissance localisée, patternable et induite par la lumière d’agrégats amyloïde d’insuline sur une surface de verre. Cette voie d’agrégation singulière ne présente pas de phase de nucléation apparente et dépend strictement de la présence de Thioflavine T. Nous avons montré que la Thioflavine T insérée entre les feuillets béta et qui peut être excitée à 440 nm fournit localement l’énergie nécessaire pour la transition de conformation de l’insuline native adsorbée vers l’état agrégé. Cette méthode permet d’obtenir une croissance différentielle entre des zones de surface hydrophile et hydrophobe.
Origine : Version validée par le jury (STAR)