Expression exosomale de protéines synaptiques cibles d'intérêt pharmacologiques

Exosomal expression of synaptic proteins targets of pharmacological interest

• Auteur / Autrice : Richard Desplantes
• Direction : Oussama El Far
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Neurosciences
• Date : Soutenance le 08/09/2017
• Etablissement(s) : Aix-Marseille
• Ecole(s) doctorale(s) : École Doctorale Sciences de la Vie et de la Santé (Marseille)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Unité de neurobiologie des canaux ioniques et de la synapse
• Jury : Président / Présidente : Nouara Yahi
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Nouara Yahi, Guillaume Van Niel, Bernard Poulain, Didier Hilaire, José Boucraut
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Guillaume Van Niel, Bernard Poulain

Mots clés

Mots clés contrôlés

Synaptotagmines

Gangliosides

Synaptosomes

Exosomes

Clostridium botulinum

Toxines botuliniques

Mots clés libres

Exosomes

Résumé

Les neurotoxines botuliques (BoNTs) à l’origine du botulisme, présentent un intérêt thérapeutique majeur pour le traitement de diverses affections. La BoNT/B se lie aux neurones par l’intermédiaire de deux récepteurs membranaires : la synaptotagmine 2 (SYT2) et un poly-sialoganglioside de type GT1b. Dans une première partie, j’ai validé l’utilité d’un système permettant d’adresser vers les exosomes des protéines recombinantes complexes dont les récepteurs protéiques des BoNTs. Des tests de liaison de ligands spécifiques ont été réalisés avec succès. La BoNT/B se lie sur des exosomes exprimant la SYT2 en présence de GT1b avec une affinité (KD = 0.6 nM) comparable à celle obtenue avec des préparations de matériel natif. L’expression exosomale de protéines membranaires complexes représente ainsi une stratégie prometteuse pour des études pharmacologiques. Dans une seconde partie, j’ai montré que la BoNT/B se lie avec une faible affinité sur le GT1b dans des exosomes et que cette interaction n’est pas détectée dans un contexte cellulaire. En revanche la BoNT/B lie des exosomes exprimant la SYT2 avec une affinité de 40 nM ainsi que la SYT2 transfectée dans des cellules. La présence de GT1b dans les exosomes SYT2, induit un gain d’affinité d’un facteur 65. J’ai pu établir que la SYT2 lie directement le GT1b. La première lysine du domaine extra cellulaire de la SYT2 (K60) est directement impliquée dans cette interaction et sa mutation affecte la liaison de la BoNT/B sur le double recepteur SYT2/GT1b. À partir de ces résultats, nous proposons un nouveau modèle de liaison pour la BoNT/B, dans lequel la toxine interagit avec un co-récepteur SYT2/GT1b préalablement assemblé.

Botulinum neurotoxins (BoNTs) that are involved in botulism are also of major therapeutic interest for the treatment of several neurological conditions. To enter neurons, BoNT/B binds two membrane receptors: synaptotagmin 2 (SYT2) and GT1b, a poly-sialoganglioside. In a first part, I validated the utility of exosomes expressing recombinant forms of several complex membrane proteins, including protein receptors of BoNTs. Specific ligand-binding assays have been successfully performed. BoNT/B binds to exosomes expressing SYT2 and GT1b with affinity (KD = 0.6 nM) comparable to that found on native nerve-ending preparations. The exosomal expression of complex membrane proteins thus represents a promising technology for many pharmacological studies. In a second part of this study, I have shown that BoNT/B transiently binds with very weak affinity to GT1b in exosomal membranes and that this interaction is not detected in a cellular context. In contrast, BoNT/B binds to SYT2 on exosomes with an affinity of 40 nM as well as to transfected SYT2 in cultured cells in the absence of gangliosides. The presence of GT1b in SYT2 exosomes induces a 65-fold increase in BoNT/B affinity. I was able to establish that the extracellular juxta-membrane domain of SYT2 directly binds to the polar head of GT1b. The first lysine residue of SYT2 extracellular domain (K60) is involved in this interaction and its mutation affects the binding of BoNT/B to the dual receptor SYT2/GT1b. On the basis of these results, we propose a new model for synaptic terminal recognition by BoNT/B, in which the toxin interacts with a previously assembled SYT2/GT1b co-receptor.