Analyse par de nouveaux outils de fluorescence du mécanisme de la protéine UHRF1 dans la méthylation de l'ADN

Epigenetic DNA modification monitored by a new fluorescence based tool

• Auteur / Autrice : Vasyl Kilin
• Direction : Yves Mély
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biophysique
• Date : Soutenance le 26/02/2016
• Etablissement(s) : Strasbourg
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Strasbourg ; 2000-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire de biophotonique et pharmacologie (Strasbourg)
• Jury : Président / Présidente : Françoise Dantzer
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Yves Mély, Françoise Dantzer, Jean-Louis Mergny, Olivier Mauffret, Alain Burger
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Jean-Louis Mergny, Olivier Mauffret

Mots clés

Mots clés contrôlés

Spectroscopie de fluorescence

Épigénétique

Méthylome

Mots clés libres

Éthylation de l'ADN

Épigénétique

5-méthylcytosine

Analogues de nucléobases

Fluorescence

Cinétique

DNA methylation

Epigenetic

Methylcytosine

Environment-sensitive nucleobase analogues

Fluorescence

Kinetic

Résumé

Les profils de méthylation de l’ADN sont des marques épigénétiques essentielles contrôlant l'expression génétique spécifique des tissus. Ces profils sont fidèlement reproduits par l’enzyme DNMT1 qui est dirigée par la protéine UHRF1 vers les sites CpG hémiméthylés (HM). La spécificité élevée d’UHRF1 vis-à-vis de ces sites CpG HM est liée à la capacité de son domaine SRA de basculer sélectivement les résidus méthylcytosine (mC). Par conséquent, la compréhension de la capacité d’UHRF1 à lire les séquences d'ADN et de basculer leurs résidus mC est une question importante en épigénétique moléculaire. Dans le présent travail, nous avons utilisé des analogues de nucléobases sensibles à l'environnement pour étudier le basculement de base induit par SRA. Nous avons découvert qu’un étiquetage par la 2-thiényl-3-hydroxychromone (3HCnt) à proximité de la cible CpG méthylée, permet le suivi de ce basculement SRA-induit de mC et de sa dynamique. Les spectroscopies de fluorescence à l'état stationnaire et de "stopped flow" ont montré des différences significatives entre les ADNs HM et non méthylé (NM) vis-à-vis de la reconnaissance et la cinétique de liaison du SRA. Effet, nous avons montré que SRA est capable de se lier et de glisser avec une cinétique rapide sur le duplex NM, en accord avec le rôle de lecteur d’UHRF1. Par contre, la cinétique de basculement de mC s’avère beaucoup plus lente, ce qui augmente sensiblement la durée de vie d’UHRF1 lié à un site CpG hémi-méthylé et donc la probabilité de recruter DNMT1 afin de dupliquer fidèlement le profil de méthylation de l’ADN. Nous avons ainsi obtenu pour la première fois un test capable de suivre le basculement de la base induit par UHRF1, ce qui nous a permis de proposer un mécanisme pour le recrutement de DNMT1 par UHRF1 sur les sites HM.

DNA methylation patterns are key epigenetic marks which control tissue specific gene expression. These patterns are faithfully replicated by the DNMT1 enzyme which is directed by the UHRF1 protein to hemi-methylated (HM) CpG sites. The high specificity of UHRF1 to HM CpG sites is related to the ability of its SRA domain to selectively flip methylcytosine (mC) residues. Therefore, the understanding of how UHRF1 reads DNA sequences and flips mC residues is an important question in molecular epigenetics. In the present work, we apply environment-sensitive nucleobase analogues to study the SRA-induced base flipping. We found that only labelling by 2-thienyl-3-hydroxychromone (3HCnt) outside but close to the target methylated CpG allows monitoring the SRA-induced mC-flipping and its dynamics. Fluorescence steady-state spectroscopy and stopped flow measurements showed significant differences in the recognition and binding kinetics of SRA for HM and non-methylated (NM) DNA. Indeed, SRA was found to bind and slide with fast kinetics on NM duplexes, in line with the reader role of UHRF1. In contrast, the kinetics of mC flipping was found to be much slower, substantially increasing the lifetime of UHRF1 bound to a CpG site in HM duplexes and thus, the probability of recruiting DNMT1 in order to faithfully duplicate the DNA methylation profile. Therefore, we proposed for the first time an assay able to sensitively monitor the UHRF1-induced base flipping, which helped us to provide a possible mechanism for the UHRF1 directing function on DNMT1.