Clostridium botulinum, du génotypage de la toxine en passant par les flagellines jusqu'au séquençage de génomes : un aperçu de la diversité génétique des Clostridies associés au botulisme animal et humain

Clostridium botulinum, from toxin and flagellin genotyping to Whole Genome Sequencing : an insight into genetic diversity of human and animal botulism associated clostridia’s

• Auteur / Autrice : Cedric Woudstra
• Direction : Patrick Fach
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
• Date : Soutenance le 21/03/2016
• Etablissement(s) : Paris Est
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Agriculture, alimentation, biologie, environnement, santé (Paris ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire de sécurité des aliments de Maisons-Alfort et de Boulogne-sur-Mer
• Jury : Président / Présidente : Henri-Jean Boulouis
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Patrick Fach, Hervé Morvan, Pierre Wattiau, Martin Dorner
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Daniel Gillet, Frédéric Carlin

Mots clés

Mots clés contrôlés

Flagelles (biologie)

Clostridium botulinum

Toxines botuliques

Mots clés libres

Clostridium botulinum

Genotypage

Flagelline

Sequençage

Génome

Clostridium botulinum

Genotyping

Flagellin

Whole Genome Sequencing

Résumé

Le botulisme est une maladie nerveuse, commune à l’homme et aux animaux, due à l’action de la toxine botulique produite par Clostridium botulinum. Il existe 8 types de toxines dénommées A à H. Les bactéries capables de produire cette toxine se différencient en six groupe sur la base de leurs caractéristiques phénotypiques et biologiques. Les souches de C. botulinum responsables du botulisme humain appartiennent aux groupes I et II selon qu’elles soient protéolytiques ou non. Elles produisent les toxines A, B, E et F, ainsi que le nouveau type H récemment découvert. C. butyricum et C. baratii sont également capables de produire les toxines botuliques de type F et E et appartiennent au groupe V et VI. C. argentinense appartient au groupe IV et est capable de synthétiser la toxine de type G. Elle a été soupçonnée d’être impliquée dans des cas de botulisme infantile en Argentine. Les souches de C. botulinum responsables du botulisme animal appartiennent au groupe III (C. novyi sensu lato) et produisent les toxines C, D et leurs formes mosaïques C/D et D/C. La toxine botulique est le poison le plus puissant connu à ce jour. La dose létale nécessaire pour tuer une personne en bonne santé par intoxication alimentaire est de 70 µg seulement. C’est pourquoi cette toxine a fait l’objet d’études particulièrement approfondies, notamment celles impliquées dans des cas de botulisme humain. Elle peut également être utilisée pour le traitement de certaine pathologie ou la chirurgie esthétique (Botox). Malheureusement, elle peut également être utilisée à mauvais escient, en tant qu’arme de guerre ou à des fins de bioterrorisme. C’est pourquoi l’emploi de la toxine botulique ou de sa bactérie productrice fait l’objet d’une législation particulièrement stricte. Mon projet de doctorat s’est organisé autour de plusieurs projets de recherche visant à développer des méthodes de détection et de typage de du germe et de sa toxine (projets Européens BIOTRACER et AniBioThreat ; projets NRBC-bio ; LNR botulisme aviaire en France). Lors de mes recherches j’ai concentré mon travail sur le développement de méthodes capable de suivre et remonter à la source d’une contamination, qu’elle soit délibérée, accidentelle ou naturelle. Afin d’y parvenir j’ai investigué les gènes des flagellines de C. botulinum groupe I à III, responsables du botulisme humain et animal. L’analyse des gènes flaA et flaB a mis en évidence 5 groupes majeurs et 15 sous-groupes, certain étant spécifiques de régions géographiques. FlaB s’est montré spécifique de C. botulinum type E. Les gènes flagellines fliC, spécifiques à C. botulinum du groupe III, se divisent 5 groupes, avec fliC-I et fliC-IV associés aux types mosaïques C/D et D/C. J’ai étudié la prévalence des souches productrices de toxine de type mosaïques chez les volailles et les bovins. Les résultats montrent que les types C/D et D/C sont majoritaires en Europe. Enfin, j’ai séquencé 17 génomes provenant de souches responsables de botulisme animal en France (14 types C/D et 3 types D/C). Leur analyse montre que ces souches sont très proche génétiquement, entre elles et avec les souches Européennes. Grâce à ces données j’ai mis en évidence un large contenu extra chromosomique dans les souches C/D, qui peut être utilisé pour créer une carte d’identité génétique. D’autre part, l’étude des séquences Crisps à des fins de typage ne s’est pas avérée suffisamment résolutive, du fait de système Crispr-Cas déficient chez les souches C/D. Enfin, un très haut degré de discrimination a été atteint par typage SNP, qui a permis de distinguer jusqu’à l’origine de chaque souche. L’ensemble de ces résultats est développé dans le présent manuscrit

Clostridium botulinum is the etiologic agent of botulism, a deadly paralytic disease that can affects both human and animals. Different bacteria, producing neurotoxins type A to H, are responsible for the disease. They are separated into different groups (I to VI) on the basis of their phenotypical and biological characteristics. Human botulism is mainly due to Groups I and II producing neurotoxins A, B, E and F, with type H recently discovered. Also C. butyricum and C. baratii species (Groups V and VI), producing toxins type F and E respectively, are scarcely reported. C. argentinense Group IV, producing toxin type G, which has been suspected to be associated with infant botulism in Argentina. Animal botulism is mainly due to Group III, which is constituted by C. novyi sensu lato species. They produce toxin types C, D and their mosaic variants. Botulinum neurotoxins are the most powerful toxin known to date with as little as 70 µg enough to kill a person by food poisoning. Therefore, it received a great deal of attention. Botulinum neurotoxins have been deeply studied, especially human related toxins compared to animal. The toxins found to be useful for medical or cosmetic (Botox) treatments, but it was also used as a biological warfare agent, and for bioterrorism. Its extreme potency is equal to its dangerousness. Therefore, governments show concerns of its potential misuse as a bioterrorism weapon; research programs are funded to study and raise awareness about both the toxins and the producing organisms. My PhD work was structured by the different projects I was involved in, which were related to C. botulinum detection and typing, like BIOTRACER and AniBioThreat European projects, the French national CBRN program, or the NRL for avian botulism. The main transversal objective I followed lead me to develop new methods to trace back the origin of C. botulinum contamination, in case of a deliberate, accidental or naturally occurring botulism outbreak. I investigated flagellin genes as potential genetic targets for typing C. botulinum Group I-II and III, responsible for human and animal botulism respectively. Flagellin genes flaA and flaB showed the investigated C. botulinum Group I and II strains to cluster into 5 major groups and up to 15 subgroups, some being specific for certain geographical areas, and flaB being specific to C. botulinum type E. Flagellin fliC gene investigated in C. botulinum Group III showed to cluster into five groups, with fliC-I and fliC-IV associated to type C/D and D/C respectively, being not discriminative enough to differentiate highly genetically related strains. I also studied the prevalence of mosaic toxin genes in C. botulinum Group III in animal botulism, mainly in poultry and bovine. The results brought out the mosaic toxin types C/D and D/C to be predominant in the samples investigated throughout Europe. Finally, I explored the full genome sequences of 14 types C/D and 3 types D/C C. botulinum Group III strains, mainly originating from French avian and bovine botulism outbreaks. Analyses of their genome sequences showed them to be closely related to other European strains from Group III. While studying their genetic content, I was able to point out that the extrachromosomal elements of strains type C/D could be used to generate a genetic ID card. Investigation of Crispr typing method showed to be irrelevant for type C/D, due to a deficient Crispr-Cas mechanism, but deserve more investigation for type D/C. The highest level of discrimination was achieved while using SNP core phylogeny, which allowed distinguishing up to the strain level. Here are the results I’m going to develop in this manuscript