Etudes structurales et fonctionnelles de la nitrate réductase A par spectroscopie RPE à haute résolution

Stuctural and functional studies of nitrate reductase A probe by high resolution EPR spectroscopy

• Auteur / Autrice : Julia Rendon
• Direction : Bruno Guigliarelli, Stéphane Grimaldi
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences chimiques
• Date : Soutenance le 13/12/2016
• Etablissement(s) : Aix-Marseille
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences Chimiques (Marseille ; 1996-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Bioénergétique et Ingénierie des Protéines (Marseille ; 2012-....)
• Jury : Président / Présidente : Stéphane Viel
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Petra Hellwig, Axel Magalon
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Pierre Dorlet, Carole Duboc

Mots clés

Mots clés contrôlés

Biogéochimie

Escherichia coli

Enzymes à molybdène

Spectroscopie de résonance paramagnétique électronique

Modèles chimiques

Mots clés libres

Bioénergétique

Spectroscopie RPE

Hyscore

Nitrate réductase A

Semiquinone

Ion MoV

Physique nucléaire

Bioenergetics

EPR spectroscopy

Hyscore

Nitrate reductase A

Semiquinone

Ion MoV

Nuclear physics

Résumé

Mon objectif a consisté à élucider à l'échelle moléculaire le fonctionnement des systèmes enzymatiques complexes impliqués dans des processus de conversion d'énergie chez les êtres vivants. Je m'intéresse en particulier à la compréhension de deux étapes clés du fonctionnement commun à un grand nombre de ces systèmes, à savoir (i) les étapes d'interaction de ces complexes avec les quinones membranaires et (ii) les mécanismes catalytiques au niveau des sites actifs à molybdène. Le système modèle que j'étudie est la nitrate réductase A issue de la bactérie E. coli, en collaboration avec l'équipe du Dr. Axel Magalon (LCB, Marseille). Il permet la respiration anaérobie en catalysant la réduction du nitrate en nitrite et joue un rôle important dans le cycle biogéochimique de l'azote. Ma recherche vise en particulier à identifier les facteurs moléculaires qui permettent d'ajuster la réactivité de ces systèmes. Cela nécessite l'obtention d'informations structurales à l'échelle atomique sur ces complexes macromoléculaires. La stratégie utilisée a consisté dans un premier temps à générer des intermédiaires paramagnétiques clefs du fonctionnement de ces systèmes (radicaux semiquinones ou ion MoV). Puis j'ai caractérisé leurs propriétés rédox par potentiométrie suivie par spectroscopie RPE. Enfin, j'ai utilisé les techniques de spectroscopie RPE impulsionnelle à haute résolution, notamment la spectroscopie de corrélation des sous niveaux hyperfins (HYSCORE) pour sonder l'environnement magnétique local de ces intermédiaires à travers la détection des interactions nucléaires hyperfines et quadripolaires qui sont trop faibles pour être visibles par spectroscopie RPE classique.

The aim of my work is to elucidate at the molecular level the structure and the function of enzymes involved in energy conversion processes in living organisms. In particular, it is focused on the understanding of two important steps found in many of these systems, namely (i) their interaction with membrane quinones acting as electron/proton shuttles and (ii) the catalytic mechanism at the molybdenum active site. The nitrate reductase A (NarGHI) from the bacterium Escherichia coli is used as a model for these studies. This membrane-bound complex reduces nitrate into nitrite during anaerobic respiration and plays therefore an important role in the global nitrogen cycle. The goal of my research is mainly devoted to the identification of the molecular factors tuning the reactivity of this system at the two active sites. For this purpose, I mainly relied on the structural characterization of key paramagnetic intermediates e.g. semiquinone radicals or Mo(V) ion using electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy in combination with rédox potentiometry. High resolution pulse EPR methods, especially Hyperfine Sublevel Correlation (HYSCORE) spectroscopy, were used to probe their local environment through the detection of hyperfine (and eventually quadrupole interactions) to nearby magnetic nuclei that are otherwise too weak to be measurable in conventional continuous wave EPR spectroscopy.