Etudes structure-fonction de complexes du ribosome humain

Structure-function studies of human ribosome complexes

• Auteur / Autrice : Heena Khatter
• Direction : Bruno Klaholz
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biophysique et biologie structurale
• Date : Soutenance le 18/09/2014
• Etablissement(s) : Strasbourg
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Strasbourg ; 2000-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de génétique et de biologie moléculaire et cellulaire (Strasbourg)
• Jury : Président / Présidente : Eric Westhof
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Lasse Bohl Jenner, Yves Mechulam

Mots clés

Mots clés contrôlés

Expression génique

Génétique moléculaire humaine

Synthèse protéique

Ribosomes

Mots clés libres

Ribosome

Synthèse protéique

80S humain

Terminaison de la traduction

Ribosome

Synthesizing proteins

Human 80S

Translation termination

Résumé

L’architecture et la régulation de la traduction eucaryote fut pendant longtemps un mystère pour les biologistes. Je présente ici un protocole détaillé pour purifier de manière homogène des ribosomes à partir de cellules HeLa, pour des études biochimiques mais également structurales. En utilisant ces ribosomes, j’ai obtenu des cristaux diffractant à faible résolution, pouvant être utilisés pour de futurs travaux. Une analyse par cryo-microscopie électronique (CME) a abouti à une structure à 5 A de résolution, permettant la construction d’un modèle. De plus, les facteurs eRF1 et eRF3 ont permis des premières études de la terminaison de la traduction par CME. Ces protéines en complexe ont également été étudiées par cristallographie aux rayons-X, montrant des interactions jusqu’alors jamais observées. L’ensemble de ce travail fournit des résultats importants pour la préparation et la description de la structure du ribosome humain, pavant la voie vers l’analyse de complexes fonctionnels.

Ribosomes comprise the translational machinery engaged in synthesizing proteins. The architecture and translation regulation of eukaryotic especially, human ribosomes, has been an enigma for a long time. I established a protocol for purifying homogenous ribosomes from HeLa cells which can be used for structural as well as biochemical analysis. Using these ribosomes, I obtained plate-like crystals of 80S diffracting to low resolution. A cryo electron microscopy analysis of these ribosomes yielded 5 Å resolution structure with secondary structures of rRNA and protein clearly visible. Furthermore, these ribosomes, along with the eukaryotic release factors (eRF1 and eRF3) purified by over-expression in bacteria, formed the basis for translation termination studies using cryo electron microscopy. Simultaneously, eRF1-eRF3 protein complex was explored by X-ray crystallography revealing new interactions. Together, this work paves the way for the analysis of functional ribosome complexes.