Résistance au fenhexamid dans le complexe d'espèces Botrytis cinerea/ Botrytis pseudocinerea : Etudes génétiques et moléculaires

Fenhexamid resistance in the species complexe of Botrytis cinerea / Botrytis pseudocinerea : genetic and molecular study

• Auteur / Autrice : Saad Azeddine
• Direction : Sabine Fillinger
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie
• Date : Soutenance le 11/06/2014
• Etablissement(s) : Paris 11
• Ecole(s) doctorale(s) : Ecole doctorale Sciences du Végétal (1992-2015 ; Orsay, Essonne)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Biologie Gestion des Risques en agriculture (Palaiseau ; 2007-....)
• Jury : Président / Présidente : Jacqui Shykoff
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Sabine Fillinger, Jacqui Shykoff, Marc Bardin, Florence Chapeland-Leclerc, Jean-Marc Nicaud, Renaud Ioos
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Marc Bardin, Florence Chapeland-Leclerc

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cytochrome P450

Résistance aux maladies

Botrytis cinerea

Mots clés libres

Pourriture grise

Botrytis cinerea

Botrytis pseudocinerea

Fenhexamid

Résistance naturelle

Métabolisation

Cytochrome P450

Gray mould

Botrytis cinerea

Botrytis pseudocinerea

Fenhexamid

Natural resistance

Metabolization

Cytochrome P450

Résumé

La pourriture grise est une maladie qui affecte de nombreuses cultures dont la vigne. Elle est provoquée par un complexe de deux espèces fongiques, l’espèce majoritaire Botrytis cinerea et l’espèce minoritaire Botrytis pseudocinerea. Les deux espèces se distinguent par leur sensibilité à certains fongicides notamment au fenhexamid, inhibiteur de la 3-cétoréductase des stérols. Ce fongicide a un spectre d’action restreint aux espèces phylogénétiquement proches du genre Botrytis (Sclerotinia et Monilinia fructicola). Son utilisation a conduit à la sélection de souches résistantes parmi lesquelles on distingue trois phénotypes : le phénotype HydR1 correspond à l’espèce B. pseudocinerea naturellement résistante ; les phénotypes HydR2 et HydR3 correspondent à l’espèceB. cinerea ayant acquis la résistance suite à l’introduction du fongicide. L’objet de cette thèse est l’étude des phénotypes HydR1 et HydR2 présents à de faibles, voire très faibles fréquences dans des populations de pourriture grise.Chez B. pseudocinerea (HydR1), nous avons identifié une monooxygénase à cytochrome P450 nommée Cyp684 responsable de la résistance au fenhexamid. Le gène cyp684 montre des polymorphismes (structure et séquence nucléotidique) entre les espèces ainsi qu’une induction par le fenhexamid chez B. pseudocinerea. La comparaison de la séquence du gène cyp684 chez plusieurs espèces de Botrytis et de leurs niveaux de résistance au fenhexamid indique que les acides aminés polymorphes de la protéine Cyp684 sont responsables de la résistance au fenhexamid chez B. pseudocinerea. Le rôle connu des monooxygénase à cytochrome P450 dans la métabolisation des xénobiotiques et la synergie entre le fenhexamid et des inhibiteurs de monooxygénases à P450 suggèrent que Cyp684 soit impliqué dans la métabolisation du fenhexamid. Concernant le phénotypeHydR2 de B. cinerea, le mécanisme de résistance reste à identifier. Les souches HydR2 se distinguent par leur phénotype rose dû à un métabolite secondaire nommé bikavérine. Le génotypage réalisé sur les descendantes d’un croisement entre une souche HydR2 et une souche sensible a mis en évidence un lien physique entre le gène ou l’allèle hydR2 et le cluster bikavérine. Afin d’identifier la niche écologique et de comprendre l'épidémiologie de B. pseudocinerea, nous avons développé une méthode de qPCR espèce spécifique, nommée « B. pseudocinerea allele specific PCR » (BpASP). Cet outil permettra de détecter et de quantifier l’espèce B.pseudocinerea dans les populations de Botrytis, selon la saison, la région géographique et les plantes hôtes.

Grey mold is a fungal disease affecting many crops including grapevine. It is generated by a species complex of two fungal species, the major one, Botrytis cinerea, and the minor species, Botrytis pseudocinerea. Both species differ by their sensitivity to several fungicides, in particular to fenhexamid, a potent inhibitor of sterol 3-ketoreductase. This fungicide has a narrow spectrum of activity limited to species closely related to the genus Botrytis (e.g., Sclerotinia and Monilinia fructicola). Fenhexamid applications have led to the selection of resistant strains with three different phenotypes: the HydR1 phenotype corresponds to the naturally resistant species B. pseudocinerea; HydR2 and HydR3 phenotypes correspond to B. cinerea strains that acquired resistance after the introduction of fenhexamid. The topic of this thesis is the study of the phenotypes HydR1 andHydR2 present at low or even very low frequencies in grey mold populations. We identified a cytochrome P450 monooxygenase named Cyp684 responsible for resistance to fenhexamid in B.pseudocinerea (HydR1). The cyp684 gene differs between both species in its gene structure, nucleotide sequence (polymorphisms) and expression. The comparison of cyp684 sequences among different Botrytis species and their resistance levels to fenhexamid indicate the polymorphic amino acids of the Cyp684 protein to be responsible for fenhexamid resistance in B. pseudocinerea. The known involvement of cytochrome P450s in xenobiotic metabolisation and synergy between fenhexamid and P450-inhibitors suggest that Cyp684 could be involved in fenhexamid metabolisation. Concerning the B. cinerea HydR2 phenotype, the resistance mechanism remains to be identified. HydR2 strains have a specific purple pigmentation due to the secondary metabolite bikaverin. Genotyping of progeny derived from a cross between a HydR2 and a sensitive strain revealed aphysical link between the hydR2 gene or allele and the gene cluster involved in bikaverin biosynthesis. In order to identify the ecological niche of B. pseudocinerea and its epidemiological behavior we developed a species-specific qPCR method named “B. pseudocinerea allele specific PCR” (BpASP). This tool will allow detecting and quantifying the species B. pseudocinerea in natural Botrytis populations, collected according to season, geographic origin or plant hosts.