Identification des déterminants moléculaires impliqués dans la stabilité des virus grippaux de type A dans l'environnement

Molecular basis of the stability of influenza A virus in the environment

• Auteur / Autrice : Louis Olivier Sawoo
• Direction : Jean-Claude Manuguerra
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Virologie
• Date : Soutenance en 2014
• Etablissement(s) : Paris 7

Mots clés

Mots clés contrôlés

Virus recombinants

Facteurs temps

Microbiologie de l'eau

Viabilité microbienne

Glycoprotéine hémagglutinine du virus influenza

Sous-type H5N1 du virus de la grippe A

Sous-type H1N1 du virus de la grippe A

Résumé

Les virus grippaux de type A sont responsables de milliers de morts, chaque année au cours d'épidémies saisonnières, et à intervalles irréguliers lors de pandémies. La dernière en date fut causée par un nouveau réassortant de virus A(H1N1) entre 2009 et 2010. La crainte des pandémies et en particulier de celle d'une possible grippe A(H5N1) d'origine aviaire, a stimulé de nombreuses études sur les mécanismes de transmission de ces virus. Cependant, les connaissances sur la façon dont l'agent ou les facteurs environnementaux influencent la persistance de ces virus restent encore rudimentaires. Etudier la survie de ces virus est importante pour mieux comprendre l'écologie des virus grippaux et pourrait aider les autorités concernées à établir et adapter les mesures d'hygiène et de protection individuelles lors de l'émergence d'une nouvelle pandémie par exemple. L'objectif de ce travail est de mieux caractériser et de comprendre les mécanismes impliqués dans la survie des virus grippaux en dehors de l'hôte. Malgré leur nature enveloppée, les virus grippaux peuvent survivre en dehors de l'hôte pendant des périodes de temps relativement élevées, mais sont sensibles à la température dans l'air et dans l'eau et à la salinité dans l'eau. De plus, il a été montré que l'origine de cette enveloppe constituait un facteur intervenant dans la survie du virus. En effet, pour deux souches de virus H5N1 et H1N1, il a été montré que celles cultivées sur cellules de mammifères (MDCK> ont persisté plus longtemps que leurs homologues amplifiées sur des cellules aviaires (QT6). Cette différence pourrait s'expliquer par les lipidomes potentiellement différents des virions néoformés. En effet, la modification en composition lipidique, en particulier en cholestérol, des virus grippaux semble directement influencer la persistance du virus en dehors de l'hôte. Les virus contenant moins de cholestérol dans leur enveloppe persistent moins longtemps. Par ailleurs, il a été montré que la perte du pouvoir infectieux observée suite à l'exposition des virus grippaux dans le milieu extérieur n'était pas due à la dégradation du génome viral. En fin de cinétique, ce génome était toujours protégé par son enveloppe virale. Suite à ces observations réalisées sur des virus sauvages, nous nous sommes intéressés aux structures externes des virions, en particulier l'hémagglutinine (HA), dont les altérations par des facteurs physiques tels que par la température pourraient avoir un impact négatif directe sur la survie virale. Pour cela, des pseudoparticules grippales à base de vecteurs lentiviraux ont été utilisées. Dans ces travaux, des pseudotypes d'une souche de virus A(H1N1) pandémique de 2009 et d'une souche de virus A(H1N1) saisonnier de 1999 ont été générés puis soumis à différents paramètres environnementaux au cours du temps comme l'avaient été les virus sauvages correspondants. La capacité des pseudoparticules à infecter de nouvelles cellules a ensuite été évaluée à différents temps de la cinétique. L'augmentation de la température et de la salinité a eu un effet négatif sur la survie des pseudotypes grippaux avec un impact plus important pour les pseudoparticules issues de virus A(H1N1) saisonnier de 1999, en accord avec les résultats expérimentaux obtenus avec les virus correspondants. D'autre part, des pseudo-particules porteuses de mutations au niveau de la HA, déterminées sur la base de la comparaison intermoléculaire des HA des deux virus sauvages, ont été générées puis utilisées dans des cinétiques de survie en milieu liquide. A la suite de ces expériences, plusieurs mutations clées ont été identifiées. Ces mêmes mutations ont, par la suite, été étudiées en utilisant des virus recombinant grippaux obtenus par génétique inverse. Pour acquérir un point de vue plus global, d'autres sous-types, tels que H3N2 et H5N1 hautement pathogène ont été inclus dans l'étude. L'ensemble de nos résultats suggère un rôle capital de l'HA et de la composition lipidique de l'enveloppe virale dans la survie des virus grippaux de type A en dehors de l'hôte.

Influenza A viruses cause thousands of deaths, each year during seasonal outbreaks and at irregular intervals the threat of enduring pandemics. The last one to date was caused by a novel influenza A (H1N1) reassortant which arose in 2009. The fear of pandemics, in particular a potential ine caused by avian H5N1 viruses has stimulated many studies on the mechanisms of transmission of these viruses. However, the knowledge about how environmental factors may influence the survival of the virus outside their host remains limited. Studying the virus survival is crucial to better understand the ecology of influenza viruses and could help authorities to establish and adapt individual hygiene and protection measures during the emergence of a new pandemic virus example. The main goal of this work is to better characterize and understand the mechanisms involved in the survival of influenza viruses outside their hosts. Despite the presence of an envelope, influenza viruses can survive outside the host for an extended period of time (higher than expected). Nevertheless, the stability of these viruses was highly affected by increasing temperatures in air, on surfaces and in water and by increasing salinities in water. Using two strains of H1N1 and H5N1 viruses, it has been shown that the origin of the viral envelope was involved in virus survival as the viral suspensions produced in mammalian cells (MDCK) remained infectious for longer period of time than those grown on avian cells. These results could mainly be explained by differences in lipid composition of the newly formed virions (QT6). Indeed, changes in lipid composition, particularly in cholesterol, directly impressed on the survival of the virus outside the host. Viruses containing a lesser extent of cholesterol in their envelope persisted for shorter periods. In parallel, it was shown that the loss of infectivity, observed when influenza viruses were exposed to the environment with various physical and chemical, was not due to the degradation of their genome. Indeed, it was also shown at the end of survival kinetics, that the viral genome was still protected by an intact viral envelope. Based on these observations, we have, thus, focused our studies on the extemal structures of the virion, in particular the hemagglutinin (HA) whose alterations by physical factors such as temperature could have a direct negative impact on viral survival. Lentiviral particles bearing influenza HA were used to test this hypothesis. In this study, pseudotypes based on the 2009 H1N1 pandemic strain and a seasonal strain of influenza A (H1N1) from 1999 were generated and subjected to different environmental conditions over time. The ability of H1 pseudotypes to infect MDCK cells was then evaluated at various time points of the survival kinetic. It has been shown that an increase in temperature and salinity had a direct negative effect on the survival of influenza pseudotypes. A higher impact was observed for H1 pseudotypes from 1999, in agreement with the experimental results obtained with the corresponding wild type influenza viruses. Moreover, pseudotypes carrying selected single point mutations in the HA were also generated and tested in survival kinetics in a liquid medium. Following these experiments, several key mutations have been identified to either increase or decrease survival time. These same mutations have subsequently been investigated using rescued influenza viruses by reverse genetics. For a more global perspective, other subtypes, such as H3N2 and highly pathogenic H5N1 viruses were included in the study. Taken together, these results suggest a pivotai role of the HA and the lipid composition of the viral envelope in the survival of influenza A viruses outside their hosts.