Création d'une banque de scFv-phages ciblant des protéines hydrophiles ou membranaires

Creation of a new scFv-phage library targeting hydrophilic or membrane proteins

• Auteur / Autrice : Benjamin Muller
• Direction : Michel Vidal
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie Santé
• Date : Soutenance le 15/12/2014
• Etablissement(s) : Montpellier 1
• Ecole(s) doctorale(s) : Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé (Montpellier ; Ecole Doctorale ; ....-2014)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Dynamique des Interactions Membranaires Normales et Pathologiques (Montpellier)
• Jury : Président / Présidente : Louis Gazzolo
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Michel Vidal, Robert Mamoun
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Louis Gazzolo, Jean-Luc Teillaud

Mots clés

Mots clés contrôlés

Exosomes

Industrie pharmaceutique

Criblage pharmacologique

Médicaments -- Mise au point

Anticorps monoclonaux

Protéines membranaires

Mots clés libres

Anticorps monoclonaux

Exosomes

Phage display

Hybridomes

Monoclonal antibodies

Exosomes

Phage display

Hybridoma

Résumé

Actuellement, 60% des médicaments sur le marché ont pour cible des protéines membranaires. Toutefois, l'étude de ces protéines membranaires reste un challenge de par leur structure particulière (domaines transmembranaires hydrophobes et domaines extra- et intra-cellulaires hydrophiles), mais également par leur faible expression sur les cellules.L'entreprise Ciloa, dans laquelle j'ai effectué ma thèse, a développé une technologie brevetée, qui permet d'exprimer à la surface des exosomes, des vésicules membranaires de tailles comprises entre 30 et 100nm, des protéines membranaires natives, grâce à un peptide d'adressage, le DCTM. Cette technologie possède de nombreux domaines d'applications, comme le criblage de médicaments, le développement de vaccins ou encore le développement d'anticorps monoclonaux.L'objectif de ma thèse a été, dans un premier temps, de mettre en place l'outil exosomes recombinants grâce à la technologie de Ciloa et dans un deuxième temps, d'utiliser ces outils pour le développement d'anticorps, grâce aux exosomes recombinants.Ainsi, j'ai d'abord mis au point différentes techniques de caractérisation des exosomes recombinants (ELISA), et également participé à la mise en place de différents protocoles de production et de purification, en fonction leur utilisation. Une fois ces outils optimisés, j'ai pu les utiliser pour le développement d'anticorps. J'ai testé en parallèle deux méthodes de production d'anticorps, une méthode classique, l'hybridation lymphocytaire après immunisation de souris BALB/c, et une méthode plus récente, le criblage d'une banque de scFvs par phage display.L'hybridation lymphocytaire a permis la production d'hybridomes, dont les anticorps ont été criblés sur exosomes, par ELISA. Dans le cadre du criblage par phage display, j'ai participé au développement d'une banque de scFvs, basée sur le modèle du 13R4, dont nous avons modifié les longueurs de boucles des différents CDRs, notamment le CDRH3, afin de cibler les épitopes faiblement accessibles des protéines membranaires. Les sélections de scFvs ont été effectuées sur exosomes recombinants, exprimant des protéines membranaires.

Nowadays, more than 60% of marketed drugs target membrane proteins. However, their study still represents a challenge, essentially due to their particular 3D-structure (hydrophobic transmembrane domains and hydrophilic extra- and intra-cellular domains), but also to their low expression level in cells.Ciloa, the start-up company in which I realized my PhD, has developed a patented technology that enables to express native membrane proteins on exosomes, membrane vesicles of 30 to 100nm, using a pilot peptide called DCTM (for Cytosolic Domain of TransMembrane). This technology displays a lot of different applications, in different domains such as drug screening, vaccines development or monoclonal antibodies (mAbs) development.The purpose of my PhD research was, first, to set up the recombinant exosomal tool using Ciloa's innovative technology, and then to use this tool to develop monoclonal antibodies.Thus, at the beginning of my PhD, I set up exosomal characterization technics, such as ELISA, and I also took part in the setup of several production and purification protocols, depending of the use of exosomes. Once these tools had been optimized, I was able to use them to develop mAbs. I tested two methods, one classical, the generation of hybridoma after Balb/c mice immunizations, and a more recent technology, the screening of scFvs library by phage display.Therefore, I obtained hybridoma and was able to screen the derived antibodies by ELISA on exosomes. Concerning the phage display technology, I took part in the development of a new scFvs library, based on the 13R4 scaffold, of which we changed the CDRs lengths, mostly the CDRH3, in order to target epitopes with low accessibility, such as the one of membrane proteins. The library screening was realized on recombinant exosomes.