Relation entre l’annexine A6 et la phospholipase D1 pendant le processus d’exocytose dans les cellules PC12

Interplay between AnnexinA6 and Phospholipase D1 during the process of exocytosis in PC12 cells

• Auteur / Autrice : Le Duy Do
• Direction : René Buchet, Slawomir Pikula
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie
• Date : Soutenance le 19/09/2014
• Etablissement(s) : Lyon 1 en cotutelle avec Instytut biologii doświadczalnej im. M. Nenckiego (Pologne)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Interdisciplinaire Sciences-Santé (Villeurbanne ; 1995-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de Chimie et Biochimie Moléculaires et Supramoléculaires (Villeurbanne, Rhône)
• Jury : Président / Présidente : Abdelkarim Abousalham
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Joanna Bandorowicz-Pikula, Saïda Mebarek Azzam, Krzysztof Zablocki
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Alain Brisson, Jean-Jacques Lacapère

Mots clés

Mots clés contrôlés

Spectroscopie infrarouge

Microscopie confocale

Annexines

Exocytose

Mots clés libres

Exocytose

Cellule PC12

Annexin A6

Phospholipase D1

Microscopie à onde évanescence

Microscopie confocale

Imagerie calcique

Spectroscopie infrarouge

Exocytosis

PC12 cell

Annexin A6

Phospholipase D1

Total internal reflection fluorescence microscopy

Laser scanning confocal microscopy

Calcium imaging

Infrared spectroscopy

Résumé

L'exocytose régulée, est un processus qui permet la communication entre les cellules à travers la sécrétion des hormones et des neurotransmetteurs. Dans les neurones et les cellules neuroendocrines, l'exocytose est strictement contrôlée par des signaux extracellulaires tels que le potentiel trans-membranaire et la fixation des ligands sur des récepteurs. Des progrès substantiels ont été effectués afin de comprendre le mécanisme moléculaire de l'exocytose. Les composants majeurs de la machinerie de sécrétion ont été dévoilés. Maintenant, la question qui émerge concerne le rôle de la plateforme de protéines qui semble avoir une action coordonnée entre chaque protéine. Dans le cas de la famille des annexines, qui est bien connue pour son action dans l'exocytose, leurs modes d'interactions séquentielles ou concertées avec d'autres protéines ainsi que leurs effets régulateurs sur l'exocytose ne sont pas encore bien établis. Des résultats précédents indiquent que l'Annexine A6 (AnxA6) affecte l'homéostasie du calcium et la sécrétion de la dopamine à partir des cellules PC12, utilisées comme un modèle cellulaire de neurosécrétion (Podszywalow Bartnicka et al., 2010). Afin de déterminer l'effet inhibiteur de l'AnxA6 sur l'exocytose de la dopamine, nous cherchons des partenaires moléculaires de l'AnxA6 dans les cellules PC12. Nous faisons l'hypothèse que l'AnxA6 interagit avec la PLD1, une enzyme active dans l'étape de la fusion des vésicules avec la membrane plasmique. En utilisant la microscopie confocale et la microscopie à onde évanescente, nous avons trouvé que l'isoforme 1 de l'AnxA6 et la PLD1 sont tous les deux recrutés sur la surface des vésicules au cours de la stimulation des cellules PC12. AnxA6 inhibait l'activité de la PLD comme indiqué par notre méthode d'analyse enzymatique au moyen de la spectroscopie infrarouge. En conclusion, nous proposons que l'AnxA6 n'est pas seulement impliquée dans la réorganisation des membranes par ses capacités à se lier avec des phospholipides négativement chargés et avec le cholestérol, mais elle influence également l'activité de la PLD1, changeant la composition lipidique des membranes

The regulated exocytosis is a key process allowing cell-cell communication through the release of hormone and neurotransmitters. In neurons and neuroendocrine cells, it is strictly controlled by extracellular signal such as transmembrane potential and ligand bindings to receptors. Substantial progress has been made to understand the molecular mechanism of exocytosis. Major components of secretory machinery have been brought to light. Now the emergent question concerns the role of scaffolding proteins that are thought to coordinate the action of each other. In the case of annexin family well known to be involved in exocytosis, their modes of –sequential or concerted- interactions with other proteins, and their regulatory effects on exocytosis are not very well established. Previous findings indicated that Annexin A6 (AnxA6) affected calcium homeostasis and dopamine secretion from PC12 cells, used as cellular model of neurosecretion (Podszywalow-Bartnicka et al., 2010). To determine the inhibitory effect of AnxA6 on exocytosis of dopamine, we were looking for molecular partners of AnxA6 in PC12 cells. We hypothesized that AnxA6 interacts with phospholipase D1 (PLD1), an enzyme involved in the fusion step. By using confocal microscopy and total internal reflection fluorescence microscopy, we found that isoform 1 of AnxA6 and Phospholipase D1 are both recruited on the surface of vesicles upon stimulation of PC12 cells. AnxA6 inhibited phospholipase D activity as revealed by our enzymatic assay based on infrared spectroscopy. To conclude, we propose that AnxA6 is not only implicated in membrane organization by its capacity to bind to negative charged phospholipids and to cholesterol, but AnxA6 is also affecting PLD1 activity, changing membrane lipids composition