Depuis quelques années, les techniques d'imagerie de fluorescence font l'objet d'une attention particulière, celles-ci permettant d'étudier de manière non invasive un nombre important de processus cellulaires. En particulier, les techniques de fluorescence en rétrodiffusion (FRI pour Fluorescence Reflectance Imaging) présentent plusieurs avantages en termes de facilité de mise en oeuvre, de rapidité et de coût, mais elles sont aussi sujettes à des limites fortes : la pénétration des tissus reste relativement faible (quelques millimètres seulement), et il est impossible d'avoir une information quantitative du fait de la diffusion des photons. L'objectif de cette thèse a été de réduire les effets des signaux parasites afin d'améliorer les performances de la FRI aussi bien au niveau du contraste que de la résolution. Pour ce faire nous avons décidé d'utiliser de nouvelles techniques d'illumination et de détection. Contrairement aux systèmes classiques qui utilisent une illumination et une détection large champ, nous balayons l'objet d'étude avec une ligne laser, des images étant acquises à chaque position de la ligne. On a alors accès à une pile d'images contenant un nombre d'informations bien plus important que dans le cas classique. Trois axes ont été suivis pour l'exploitation de ces informations. Les méthodes développées ont été testées en simulation avec le logiciel NIRFAST et un algorithme de Monte-Carlo mais aussi expérimentalement. Les validations expérimentales ont été réalisées sur fantômes optiques et en in vivo sur petit animal en les comparant à une illumination uniforme plus classique. En améliorant à la fois le contraste et la résolution, ces différentes méthodes nous permettent d'obtenir de l'information exploitable plus loin en profondeur en réduisant les effets néfastes des signaux parasites et de la diffusion.