Purification et caractérisation de signaux biologiques à l'état de traces

Purification and characterization of biological signals at trace level

• Auteur / Autrice : Marie-Anne Carpéné
• Direction : Véréna Poinsot
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie, biologie, santé - CO042
• Date : Soutenance en 2013
• Etablissement(s) : Toulouse 3

Mots clés

Mots clés contrôlés

Rhizobium

Polysaccharides

Azote -- Fixation

Symbiose

Mots clés libres

Symbiose fixatrice d'azote

Eps

Spectrométrie de masse

Rmn

Sinorhizobium meliloti

Rhizobium sullae

Résumé

Sur les sols pauvres en nutriments, les plantes de la famille des légumineuses (soja, luzerne, trèfle, haricot, etc. ) peuvent survivre grâce à la symbiose fixatrice d'azote, qu'elles établissent avec des bactéries de la famille des Rhizobiaceae. Un dialogue moléculaire contrôle la mise en place de cette symbiose. En plus des processus permettant l'infection de la plante par son symbiote, il existe différentes voies de régulation négative, dont le contrôle de la prolifération bactérienne. Lors de cette thèse, nous avons caractérisé un signal issu de la plante Medicago sativa (hôte de Sinorhizobium meliloti) qui permet de contenir cette infection. Plus précisément, nous avons déterminé qu'il s'agissait d'une protéine, sensible à la température, très minoritaire dans un extrait aqueux de feuilles. Sa masse moléculaire est comprise entre 20 et 95 kDa, et son Pi est supérieur à 9. Ces caractéristiques permettront de déterminer sa structure après plusieurs étapes de purification. Nous avons également étudié l'effet secondaire de ce signal inducteur génique sur la production et la structure des exopolysaccharides (EPS) de S. Meliloti. Nous avons constaté que la production d'EPS augmentait lorsque le signal était perçu par la bactérie, sans modification significative de leur structure. Toutefois, les EPS sont des composés connus pour être impliqués dans la mise en place de la symbiose. Si leur rôle symbiotique est bien connu, leur relation structure/activité reste floue. Nous avons donc étudié ces relations à partir des EPS produits par Rhizobium sullae, qui interagit symbiotiquement avec la légumineuse Hedysarum coronarium (sainfoin). Ce couple symbiotique a été choisi, car il présente un fort intérêt agronomique. En effet, le sainfoin colonise les zones arides et semi-désertiques du pourtour méditerranéen. Nous avons effectué la caractérisation structurale complète (GC-MS, ESI-MS, MS/MS, RMN 1D et 2D) de l'unité répétitive des EPS de R. Sullae, ce qui a permis de constater qu'ils étaient composés d'environ 30% de fucose. Ce monosaccharide est très rarement présent dans les EPS de bactéries fixatrices d'azote. Dans le cadre de l'étude des relations structure/activité, nous avons déterminé qu'un tel taux de fucose améliore la mise en place de la symbiose. Nous avons également étudié le rôle des EPS de R. Sullae dans la résistance à la sècheresse. Nous avons ainsi observé que les EPS de forte masse molaire (particulièrement visqueux) augmentent la résistance à la sècheresse, mais que la présence de fucose n'avait que peu d'influence.

In fields, when the ground is starved in nitrate and ammonium, a plant family is still able to grow, and are known as leguminous. For this performance, the plant enters in symbiosis with a family of bacteria, the Rhizobiaceae, and establishes this way the nitrogen fixing symbiosis. A molecular dialogue controls the implementation of this symbiosis. Many processes occur allowing the infection of the roots by the symbiont. Other pathways also exist that repressing this infection, particularly the bacterial proliferation. In this work, we characterized a signal produced by the plant Medicago sativa (host of Sinorhizobium meliloti) which is involved in such negative regulation. More precisely, we determined that this molecule is a protein, sensitive to temperature, at low concentration in an aqueous extract of shoots. Its molecular weight is between 20 and 95 kDa, and its Pi is higher than 9. The so determined characteristics will allow elucidating its structure after several purification steps. We have also studied a secondary effect of this signal perception, on the production and the structure of the S. Meliloti's exopolysaccharides (EPS). We observed an increased production of them, when the bacteria perceive the signal, even if no significant modifications of their structure could be detected. Actually, EPSs are known to be involved in the establishment of the symbiosis. If their symbiotic role is well documented, it is not the case for their structure/activity relationship. For this purpose, we studied such relationships on the EPSs produced by Rhizobium sullae, the wild type symbiont of Hedysarum coronarium (sweetvetch). This symbiotic pair has been chosen, because it is of ecological relevance. Actually, the sweetvetch colonize arid and semi-desert areas around the Mediterranean Sea. We conducted a complete structural characterization (GC-MS, ESI-MS, MS/MS, 1D and 2D NMR) of the R. Sullae's EPSs repeating unit. We determined that they are composed in mean of 30% of fucose. This monosaccharide is very uncommon in the bacterial and rhizobial EPS. Moreover, we demonstrated that this fucose ratio improves the symbiosis implementation. We also studied the role of these EPSs in the bacterial resistance to drought. This way, we observed that the high molecular weight EPSs (very viscous) increase the resistance to drought, where the fucose content does not play a significant role.