Toxicologie pulmonaire de nanoparticules biodégradables : effets cytotoxiques et inflammatoires sur cellules épithéliales et macrophages

Pulmonary toxicology of biodegradable nanoparticles : cytotoxic and inflammatory effects towards epithelial cells and macrophages

• Auteur / Autrice : Nadège Grabowski
• Direction : Elias Fattal
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Pharmacotechnie et Biopharmacie
• Date : Soutenance le 13/12/2013
• Etablissement(s) : Paris 11
• Ecole(s) doctorale(s) : Ecole doctorale Innovation Thérapeutique : du Fondamental à l'Appliqué (Châtenay-Malabry, Haut-de-Seine ; 2000-2015)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut Galien Paris-Saclay (Châtenay-Malabry, Hauts-de-Seine ; 1998-....) - Physico-chimie, pharmacotechnie, biopharmacie
• Jury : Président / Présidente : Saadia Kerdine-Römer
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Saadia Kerdine-Römer, Françoise Pons, Jorge Boczkowski, Hervé Hillaireau, Didier Bazile, Stéphanie Briançon
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Françoise Pons, Jorge Boczkowski

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cellules épithéliales

Macrophages

Toxicologie

Nanoparticules

Mots clés libres

Nanoparticules

Toxicologie

Poumon

Co-culture

Cellules épithéliales

Macrophages

Nanoparticles

Toxicology

Lung

Co-culture

Epithelilal cells

Macrophages

Résumé

Ce projet de thèse se propose d’évaluer le devenir, la cytotoxicité et la réponse inflammatoire pulmonaire in vitro suite à l’exposition aux nanoparticules, et plus particulièrement vis-à-vis de la région alvéolaire.Les nanoparticules étudiées sont formulées à base d’acide poly (lactide-co-glycolide) (PLGA) (polymère biodégradable), stabilisées, ou non, par différents polymères de surface (alcool polyvinylique (PVA), chitosane (CS), pluronic F68 (PF68)). Les nanoparticules ont une taille d’environ 200 nm, et présentent des charges de surface neutre (PLGA/PVA), positive (PLGA/CS) ou négative (PLGA/PF68 et PLGA sans stabilisant). Des nanoparticules non-biodégradables de dioxyde de titane (TiO2) et de polystyrène ont été choisies comme contrôle positif. Pour mimer les conditions alvéolaires, la lignée cellulaire A549 d’épithélium alvéolaire humain a été utilisée en mono-culture et en co-culture en contact direct avec des macrophages différenciés de monocytes humains (lignée THP-1). Les caractérisations phénotypique et microscopique de la co-culture, ont confirmé la présence de deux types cellulaires viables et en contact. Le CD14, récepteur membranaire exprimé uniquement par les macrophages, sera utilisé pour identifier chaque sous-population cellulaire. D’autre part, l’analyse du récepteur CD54 a montré la présence d’interactions intercellulaires en co-culture : exprimé uniquement par les macrophages en mono-culture, il est exprimé par les deux sous-populations cellulaires en co-culture. Ces interactions ont été confirmées lors de la quantification des cytokines sécrétées après exposition au lipopolysaccharide: les niveaux de sécrétions en co-culture étant jusqu’à 5 fois supérieurs aux niveaux théoriques (issus de la somme des sécrétions en mono-culture).L’analyse en microscopie confocale a confirmé que les nanoparticules sont internalisées par chaque type cellulaire, Les cinétiques d’internalisation suivies en cytométrie en flux ont montré que les nanoparticules de charge de surface négative sont internalisées en plus grande quantité que les autres, quelque soit le type cellulaire, en mono ou en co-culture, selon un mécanisme énergie-dépendant. Enfin, en co-culture, les macrophages internalisent davantage de nanoparticules que les cellules épithéliales.La cytotoxicité des nanoparticules a été évaluée par la mesure de l’activité mitochondriale, l’étude de l’intégrité membranaire, et le type de mort cellulaire. Les résultats montrent qu’à faible concentration toutes les nanoparticules de PLGA induisent une cytotoxicité généralement faible (60 à 80 % de viabilité), avec une mort exclusivement nécrotique, sans induire de forts dommages à la membrane. La toxicité des nanoparticules de PLGA/CS peut être expliquée par la toxicité propre du chitosane. A forte concentration, le cas des nanoparticules de PLGA sans stabilisant mérite d’être noté, car elles n’induisent aucune cytotoxicité vis-à-vis des macrophages, contrairement aux nanoparticules stabilisées. La cytotoxicité des nanoparticules de TiO2 est plus importante, mais peu de dommages à la membrane sont causés. La réponse inflammatoire a été évaluée par la quantification des cytokines sécrétées après 24 h d’exposition aux nanoparticules (0,1 mg/mL). En mono-culture, seules les nanoparticules de PLGA/PF68 induisent une réponse inflammatoire sur les cellules A549, corrélée à leur plus grande internalisation. En co-culture, la réponse inflammatoire est peu prononcée. En revanche, ni les polymères de surface ni les nanoparticules de PLGA sans stabilisant, n’induisent de réponse inflammatoire spécifique.Ces résultats montrent la faible toxicité des nanoparticules de PLGA vis-à-vis des conditions alvéolaires, et soulignent l’importance du recouvrement de surface. En conclusion, les nanoparticules de PLGA testées présentent un fort intérêt pour une application biomédicale, modulée par l’ajustement des propriétés de surface.

The pulmonary route has attracted great attention for the delivery of nanomedicines due to the non invasiveness, a weak enzymatic activity and potential alveolar retention and/or absorption. However, the potential pulmonary toxicity of nanoparticles raises a lot of concern, especially for manufactured, non-biodegradable nanoparticles. In this study, we design and characterize an in vitro model of lung epithelium based on a co-culture of alveolar epithelial-like cells (A549) and macrophages (differentiated from THP-1 monocytes), and use it to assess the potential toxicity of various biodegradable nanoparticles in the form of nanocarriers, as compared to non-biodegradable nanoparticles used in manufactured products. The ultimate goal is to provide a safety pattern of nanoparticles relevant for drug delivery to the lung.The co-culture was characterized by flow cytometry (analysis of three cell membrane receptors: CD14, CD11b and CD54) and confocal laser scanning microscopy. The presence of two different cell types was evidenced, as well as several cellular interactions. For instance, after exposure to a pro-inflammatory compound, synergistic effects were observed, in terms of cytokine secretions ( IL-6, IL-8, TNF-α and MCP-1). Such co-cultures are thus a valuable tool to investigate the inflammatory response following exposure to nanoparticles. On the other hand, the cell membrane receptor CD14 (expressed only by macrophages) was used as an identification tool to distinguish each cell population in co-culture.Biodegradable nanoparticles having size around 230 nm, were prepared according to an emulsion-evaporation process using poly(lactide-co-glycolide) (PLGA). The use of polyvinylalcohol (PVA), chitosan (CS) or poloxamer (PF68) as stabilizers allows the formation of, respectively, neutral, positively- or negatively-charged nanoparticles. In addition, stabilizer-free nanoparticles (negatively charged) were prepared. Commercial titanium dioxide and polystyrene nanoparticles were used as non-biodegradable nanoparticles.After exposure to nanoparticles, uptake kinetics (flow cytometry and confocal microscopy) were performed in cells in mono and co-culture. Negatively-charged nanoparticles (stabilizer-free PLGA and PLGA/PF68 nanoparticles) were found in higher quantity in each cell population. Several cytotoxicity tests (MTT, trypan blue, selective membrane permeability, lactate dehydrogenase (LDH) release) have shown a low to medium cytotoxicity of PLGA nanoparticles. The cytotoxicity of PLGA/CS nanoparticles was attributed to the cytotoxicity of the chitosan in solution, whereas the cytotoxicity of PLGA/PF68 nanoparticles was attributed to their higher uptake. After 24 h exposure to a low dose of PLGA nanoparticles, a low inflammatory response was detected. Non-biodegradable nanoparticles have shown a slightly higher toxicity.Differences observed among PLGA nanoparticles in terms of cytotoxicity, cell uptake quantity and inflammatory response highlight the importance of the coating of nanocarriers for drug delivery application.