Les myopathies congénitales avec agrégats protéiques

par Edoardo Malfatti

Thèse de doctorat en Neurologie

Sous la direction de Thomas Voit et de Antonio Federico.

Soutenue en 2013

à Paris 6 en cotutelle avec l'Università degli studi (Sienne, Italie) .


  • Résumé

    Les myopathies congénitales sont un groupe hétérogène de maladies musculaires héréditaires définies sur la base de lésions morphologiques caractéristiques observées dans la biopsie musculaire des patients atteints. Ces lésions histologiques peuvent être, en particulier, des agrégats protéiques, des ‘cores’ ou une augmentation du nombre de noyaux centralisés. Le phénotype clinique classique associe une hypotonie musculaire à début précoce et une faiblesse musculaire, associée parfois à d’autres signes cliniques comme par exemple une atteinte oculaire. Il n'existe aucun traitement spécifique pour ces maladies. Les myopathies congénitales avec agrégats protéiques sont un sous-groupe des myopathies congénitales caractérisées par la présence d’accumulations de protéines dans les fibres musculaires. L'analyse morphologique peut distinguer des agrégations non spécifiques des protéines et / ou des corps d’inclusions bien définis. Les mécanismes conduisant à l'agrégation protéique ne sont pas encore complètement élucidés. Une analyse morphologique fine et détaillée pourrait aider à éclaircir les événements responsables de ce phénomène. De nombreux ‘loci’ génétiques ou des mutations génétiques ont été identifiées dans plus de 20 formes de myopathies congénitales. Néanmoins, à l’heure actuelle une grande partie des patients atteints ne présente pas de mutations dans les gènes connus. Donc, plusieurs entités restent toujours à identifier. Pour remédier à cette lacune de connaissance, des nouvelles approches d’analyse génétique ont été élaborées. L'une des techniques la plus prometteuse est le séquençage d’exome ou séquençage à haut débit. Cette dernière consiste à l’analyse de séquençage multiple et ciblé de l'ensemble des séquences codantes du génome humain. Cet outil pourrait sûrement contribuer d’une façon déterminante à la découverte de nouveaux gènes responsables de ces maladies monogéniques rares. Mon travail porte sur l’analyse de patients atteints par trois différentes formes de myopathies congénitales avec des agrégats de protéines. Nous avons analysé à la fois des cohortes de patients avec un diagnostic moléculaire ainsi que des patients qui ne présentaient pas de mutations dans les gènes connus. Les trois pathologies étudiées sont : la myopathie à corps réducteurs ou ‘reducing body myopathy‘ (RBM), myopathie némaline ou ‘nemaline myopathy’ (NM) et, la myopathie avec structures cap ou ‘cap disease’(CD). Nous nous sommes concentrés sur trois axes principaux: 1 -. Analyse morphologique et étude des mécanismes physiopathologiques qui sous-tendent l'apparition des agrégats de protéines chez les patients atteints RBM et autre phénotype associé à des mutations dans le gène FHL1. 2 -. Caractérisation clinique et morphologique des familles présentant des formes néonatales de NM et CD sans caractérisation génétique moléculaire. 3 -. Validation fonctionnelle de l'expression protéique de mutations dans des nouveaux gènes identifiés par séquençage d’exome chez des patients avec myopathie congénitale génétiquement non identifiée. Dans la première partie de cette étude, j'ai analysé un groupe de dix-huit patients présentant une RBM ou d’autres phénotypes associés à des mutations dans le gène FHL1. Les mutations dans ce gène ont été associées à des phénotypes hétérogènes, y compris la ‘reducing body myopathies’ (RBM), le ‘X-linked scapuloperoneal syndrome’ (X-SPM), la ‘X-linked muscular postural atrophy’ (XMPMA), la ‘Emery-Dreifuss-muscular dystrophy’ (EDMD), et une forme de myocardiopathie isolée (HCM), ainsi que des formes de chevauchements. J'ai mené une analyse immunohistochimique, ultrastructurale et en immunogold comparative détaillée chez 14 patients RBM (groupe 1), 3 patients EDMD, et un patient avec HCM et hypertrophie musculaire (groupe 2). L'analyse des biopsies musculaires pour le groupe 1 a montré des ‘reducing bodies’ (RBs) associés à des corps cytoplasmiques comme caractéristique récurrente. Les RBs présentaient une franche immunoréactivité avec l’anticorps FHL1. Du matériel réactif pour la desmin, alphaB-cristalline et la myotiline a été observée autour des RBs. En microscopie électronique (EM), les RBs étaient composés de matériel tubulofilamenteux dense qui se propage progressivement entre les myofibrilles et autour des noyaux musculaires. En utilisant des techniques d’immunogold, nous avons démontré que la protéine FHL1 se trouve uniquement à l'intérieur de RBs. Les échantillons du groupe 2 ont montré uniquement des anomalies dystrophiques légères, sans RBs. Avec la EM nous avons observé seulement des anomalies myofibrillaires aspécifiques. L'analyse moléculaire a révélé des mutations faux-sens dans le 2ème domaine LIM FHL1 chez les patients du groupe 1. Chez les patients du groupe 2 nous avons trouvé des mutations INS / DEL ou faux-sens dans le 4ème domaine LIM FHL1. Grâce à cette étude, j'ai pu analyser et décrire en détails les caractéristiques morphologiques des patients RBM, ainsi que démontrer clairement la localisation de la protéine FHL1 dans les RBs. J’ai pu également illustrer les différences morphologiques majeures entre différentes myopathies liées au gène FHL1 (Malfatti et al. , JNEN 2013). La deuxième partie du projet a porté sur l’analyse morphologique détaillée chez plus de 100 patients présentant une myopathie congénitale. Nous avons identifié des cohortes homogènes de patients sans diagnostic moléculaire qui présentaient des myopathies congénitales d’apparition prénatale ou néonatale avec agrégats protéiques. L’analyse d’exome d'un premier groupe de cinq patients a permis l'identification de mutations autosomique récessive dans le gène RYR1 chez trois patients ; les deux derniers patients ont été trouvés mutés dans le gène de la nebuline (NEB) Cette étude a permis de démontrer qu'une analyse morphologique détaillée de patients présentant des formes néonatales sévères de myopathies congénitales oriente vers un diagnostic génétique précis. Elle a également confirmé que les myopathies congénitales présentent une large hétérogénéité génétique et phénotypique et que le séquençage d’exome est un outil de diagnostic rapide et efficace, surtout pour l’analyse des grands gènes (Bohm, Vasli, Malfatti et al. , PlosONE 2013). L'analyse morphologique visant à l'identification des cohortes homogènes pour l’étude d’exome a permis de mettre en évidence certains patients présentant un tableau morphologique particulier. Un de ces patients présentait une association particulière de bâtonnets et de structures ‘caps’ dans sa biopsie musculaire. Cette association histologique n'avait jamais été signalée auparavant. L’analyse d’exome a révélé une mutation AD du gène TPM3. Le gène de l’'a-tropomyosine (TM) lente, TPM3, code pour une protéine des filaments fins exprimé uniquement dans les fibres musculaires de type I. Des mutations dans le gène TPM3 ont été associées à trois tableaux histologiques différents : la myopathie nemaline (NM), la myopathie congénitale identifiée avec disproportion de type de fibres (CFTD) et, plus récemment, la ‘Cap disease’ (CD). Ces derniers ont été décrits que séparément auparavant. L'identification d'un patient présentant une association unique de ‘Cap’ et bâtonnets dans sa biopsie musculaire nous a permis d'élargir le spectre morphologique de patients mutés TPM3, et d’affirmer la proximité histologique de différentes myopathies liées à des mutations du gène TPM3 (Malfatti et al. , Neuromuscular Disorders 2013). La troisième partie de ce deuxième axe a consisté à effectuer le séquençage d’exome d’un groupe de quatorze patients avec différentes formes cliniques de myopathie némaline. Cette analyse a mené à l’identification de mutations autosomiques récessives dans le gène nébuline (NEB). Afin de mieux caractériser ce groupe de patients nous avons effectué une analyse morphologique détaillée du muscle chez ces patients. Nos objectifs étaient la recherche de corrélations clinico-morphologiques et la constitution de groupes homogènes au point de vue histologique. Quatre groupes ont été identifiés en fonction de la sévérité clinique et de l'âge à la biopsie musculaire. Le Groupe 1 (n = 4) comprend des NM graves /lethales et une biopsie musculaire effectuée durant les premiers jours de vie. Le Groupe 2 (n = 5) comprend NM sévères et une biopsie après un mois de vie. Le Groupe 3 (n = 3) comprend NM typiques et une biopsie faite dans l'enfance, et le groupe 4 (n = 2) comprend des formes légères de NM et une biopsie faite à l'âge adulte. Les biopsies ont été analysées au point de vue histoenzymologique, immunohistochimique et ultrastructurale. La distribution des bâtonnets, leurs caractéristiques ainsi que la répartition des types des fibres ont été étudiés. Tous les patients présentaient des mutations NEB compatibles avec un mode de transmission AR. Chez le patients du G1 nous avons identifié une prédominance de type 2, contrairement à ce qui avait été décrit chez les patients avec myopathies congénitales ; Les bâtonnets étaient présents dans 1/3 de fibres musculaires et avaient une forme plutôt carré. L’analyse ultrastructurale a révélé un pourcentage élevé de fibres avec importante désorganisation sarcomérique. Le G2 a montré une predominance type allant jusqu’à une uniformité de type 1. Les bâtonnets présentaient une forme et une répartition variable au milieu de la fibre. L’analyse en ultrtastructure a montré la présence de rares fibres avec désorganisation sarcomérique. En revanche, le G3 et G4 ont présenté une uniformité de type 1 associé à des groupes bien délimité de bâtonnets sous-sarcolemmaux ayant une forme préférentiellement allongée. Il n’y avait pas de désorganisation sarcomérique majeure. En conclusions: 1) Nous avons observé la persistance de prédominance de type 2 dans la biopsie musculaire des nouveau-nés présentant des formes létales liées à des mutations NEB. 2) Nous avons démontré une corrélation directe entre la désorganisation sarcomérique et la sévérité clinique. La présence de groupement des bâtonnets bien délimités chez les patient moins sévères suggère une réponse musculaire d’autoprotection contre la diffusion / propagation des bâtonnets à l’intérieur de la fibre musculaire chez ces derniers patients. (Malfatti et al. , en préparation). La troisième partie de l'étude concerne l’analyse précise des lésions morphologiques particulières présentes dans la biopsie musculaire d’une famille dont les résultats de séquençage d’Exome effectuée par la équipe du Dr Nigel Clarke / Pr Kathrin North de l’Université de Sidney ont mis en évidence des mutations dans un nouveau gène. Dans ce cadre, j'ai effectué une analyse clinique, morphologique, en immunofluorescence (IF) et en microscopie électronique d’une cohorte de nouveau-nés (N = 20) présentant un phénotype clinique ou morphologique similaire. De plus, nous avons effectué une analyse en immunofluorescence avec des anticorps dirigés contre la protéine codée par le nouveau gène. Cette étude a permis de démontrer une absence d’expression de cette protéine chez les patients mutés. En revanche, nous n’avons pas observé d’altération de l’expression protéique (expression absente ou réduction) chez les autres patients analysés. Les résultats de ces deux études représentent des données préliminaires et strictement confidentielles.

  • Titre traduit

    Congenital myopathies with protein aggregates


  • Résumé

    Congenital myopathies are a heterogeneous group of inherited muscle disorders defined according to the characteristic morphologic lesions observed in the patient muscle biopsies. These lesions could be protein aggregates, cores, and an increased number of central nuclei. The clinical phenotype consists of hypotonia and muscle weakness from infancy, variably associated with other clinical characteristics. There is no specific treatment for these conditions. The congenital myopathies with protein aggregates are a subgroup of congenital myopathies characterized by aggregations of proteins in muscle. Morphological analysis of muscle can distinguish between nonspecific protein aggregations and/or well-defined inclusion bodies, patches or clusters. Mechanisms leading to protein aggregation still remain not completely elucidated. A deep morphological analysis could help in elucidating the events responsible for this phenomenon. Numerous gene loci or gene mutations have been identified in more than 20 forms of congenital myopathies. Nevertheless a large portion of affected patients is not mutated in the known genes. Several unknown entities remain to be discovered. To overcome this gap of knowledge novel approaches are being developed. One of the most promising is next generation or exome sequencing that consists in targeted re-sequencing of all coding sequences within the genome. This tool will surely help the discovery of new genes underlying these rare monogenic diseases. In this study we concentrated in affected by three different forms of congenital myopathies with protein aggregates with or without molecular diagnosis: Reducing Body Myopathy (RBM), Nemaline myopathy (NM) and Cap disease (CD). My activity was focused on three main axes: 1. - Morphological analysis and investigation of pathophysiological mechanisms underlying the appearance of the protein aggregates in patients with RBM and other phenotype associated with mutation in the FHL1 gene. 2. - Clinical and morphological characterisation of families affected by neonatal forms of NM and CD without a genetic characterization. 3. - Functional validation of protein expression of mutations in novel genes identified through next generation sequencing in families presenting with non-diagnosed congenital structural myopathy. In the first part of my study I analysed a group of eighteen patients presenting RBM and other phenotype associated with mutations in the FHL1 gene. FHL1 mutations have been associated with different disorders including reducing body myopathy (RBM), scapuloperoneal syndrome (X-SPM), X-linked myopathy with postural atrophy (XMPMA), Emery-Dreifuss-like muscular dystrophy (EDMD), isolated hypertrophic cardiomyopathy (HCM), and some overlapping conditions. I conducted a detailed histochemical, immunohistochemical, ultrastructural, and immunoelectron microscopy comparative analysis in 14 RBM (group 1), 3 EDMD, and one patient with HCM and muscular hypertrophy (group 2). The analysis of muscle biopsies in group 1 showed reducing bodies (RBs) associated with cytoplasmic bodies as a constant feature. RBs had a prominent FHL1 immunoreactivity. Desmin, alphaB-crystallin and myotilin immunoreactivity was observed surrounding RB. Under electron microscopy (EM), RBs were composed of electron dense tubulofilamentous material that progressively spreads between the myofibrils and around myonuclei. Using immunoelectron microscopy we demonstrated that FHL1 protein is found uniquely inside RBs. Samples from group 2 showed mild dystrophic abnormalities, without RBs. Only minor non-specific myofibrillar abnormalities were observed under EM. Molecular analysis revealed missense mutations in the 2nd FHL1 LIM domain in group 1 patients and ins/del or missense mutations within the 4th FHL1 LIM domain in patients from group 2. With this study I was able to expand the morphological features of RBM, clearly demonstrating the localization of FHL1 in RB, and further illustrating major morphological differences between different FHL1-related myopathies (Malfatti et al. , JNEN 2013). In the second part of the project we performed a deep morphological analysis in our cohort of more than 100 patients presenting a congenital myopathy and we identified homogeneous cohorts of patients presenting neonatal or antenatal onset congenital myopathies with protein aggregates. The exomes of a first group of five patients from four unrelated families presenting with different skeletal muscle pathologies, including a fatal nemaline myopathy with neonatal onset, arthrogryposis and severe respiratory failure, a severe congenital myopathy with internal nuclei and myofibrillar desorganization were sequenced (analysis conducted by Jocelyn Laporte group. ANR Programme Blanc Edition 2011: Identification of novel genes implicated in structural congenital myopathies by exome sequencing to Dr Jocelyn Laporte, IGBMC, UMR7104 INSERM, Illkirch, France, and Dr Norma Beatriz Romero, Unité de Morphologie Neuromusculaire, Institut de Myologie, CHU La Pitié-Salpêtrière). This analysis leads to the identification of autosomal recessive RYR1 mutations in in three patients with different clinical and histological features. RYR1 codes for the skeletal muscle ryanodine receptor, a key player in skeletal muscle excitation-contraction coupling. The two other sporadic patients with fatal neonatal myopathy were found to harbor mutations in NEB, encoding the contractile unit scaffold protein nebulin. We therefore demonstrated that a deep morphological analysis of patients presenting severe neonatal forms of congenital myopathies could help in the orientation toward a specific genetic diagnosis. This study confirmed that congenital myopathies present with broad genetic and phenotypic heterogeneity and that Exome sequencing is a fast and efficient diagnostic tool, especially for large genes (Bohm, Vasli, Malfatti et al. PlosONE 2013). The deep morphological analysis conducted for the identification of homogenous cohorts to be screened by exome analysis allowed the identification of some peculiar and morphologically unique patients. One of this presented a striking combination of cap structures and typical nemaline bodies in his muscle biopsy. This histological association was never reported before. Exome sequencing analysis revealed a recurrent mutation of TPM3 gene. The a-tropomyosin (TM) slow gene, TPM3, codes for a thin filament protein expressed uniquely in type I muscle fibres. The latter belongs to a highly conserved family of actin-binding proteins (TM) that plays important roles in a wide range of cellular process. Tropomyosin is essential for the regulation of muscle contraction. A lack of or an abnormal tropomyosin could explain muscle atrophy and weakness. However the exact mechanisms leading to muscle weakness remains unclear. Mutations in TPM3 have been associated with three distinct and separate histological pattern: nemaline myopathy (NM), myopathy identified as congenital fibre-type disproportion (CFTD) and, more recently, cap disease. These extremely variable histological patterns spanning from protein inclusions (e. G. Rods and caps) to an isolated defect of type 1 fibres, have been encountered only separately. The identification of a patient presenting a unique association of caps and rods allowed us to enlarge the morphological spectrum TPM3 mutated patients, and tightens the histological boundaries of TPM3-related myopathies (Malfatti et al. , Neuromuscular Disorders 2013). The exomes sequencing, successively confirmed by dHPLC/Sanger-sequencing, in a group of fourteen patients with different clinical form of Nemaline myopathies lead to the identifications of autosomal recessive mutations in the nebulin (NEB) gene. To better characterize this group of patients we performed a detailed muscle morphological analysis of this cohort of fourteen NEB-mutated patients to define pathological patterns and clinical-morphological correlations. Four groups were identified according to clinical severity and age at biopsy. Group 1 (n=4) comprises severe/lethal NM and biopsy in first days. Group 2 (n=5) comprehends severe NM and biopsy after one month. Group 3 (n=3) comprises typical NM and biopsy in childhood, and group 4 (n=2) patients with mild NM and biopsy in adulthood. Biopsies underwent histoenzymological, immunohistochemical and ultrastructural analysis. Fiber type distribution, rod characteristics, distribution and localization were investigated. All patients presented NEB mutations consistent with AR inheritance. G1 failed to show type 1 fiber predominance and had scattered squared rods in 1/3 of fibers. Ultrastructural analysis revealed high percentage of fibers with sarcomeric disarray. G2 showed a variable pattern of fiber type distribution spanning from slight type 2 predominance to type 1 uniformity. Rods presented variable distribution and shape. Ultrastructural analysis revealed rare fibers with sarcomeric disarray. In contrast, G3 and G4 presented a homogeneous type 1 uniformity associated with well-delimited subsarcolemmal and/or cytoplasmic elongated rods without sarcomeric alterations. In conclusions we 1) identified an unreported absence of type 1 predominance in muscle biopsy of new-borns patients presenting severe NEB-related NM; 2) suggest a direct correlation between the association of sarcomeric disarray and clinical severity. The presence of well-delimited clusters of rods in milder affected subjects suggests a muscle self-protective response against rod diffusion/propagation (Malfatti et al. In preparation). The third part of the study concern the deep clinical and morphological analysis of family presenting mutations in a new gene identified through Exome sequencing effectuated by the team of Dr Nigel Clarke/Pr Kathrin North, University of Sidney. I performed a peer clinical, morphological, immunofluorescence (IF) and ultrastructural analysis of this family. Furthermore I proceeded to an IF screening using a panel of different antibodies raised against the protein coded by the newly identified gene on muscle biopsy from our cohort of patient (N=20) presenting similar phenotype/morphotype. IF analysis showed an absence of the protein expression on the muscle biospies from mutated patients. On the contrary we failed to show a reduced protein expression in the biopsied muscle of the other patients. The results of these two studies are preliminary confidential data.

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  • Détails : 1 vol. (153 p.)
  • Annexes : Bibliogr. p.137-140. Index

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