Confocal angle resolved linear dichroism microscopy for structural fluorescence imaging

par Xiao Wang

Thèse de doctorat en Optique, Phonotique, et Traitement de l'image

Sous la direction de Sophie Brasselet.

Soutenue en 2013

à l'Ecole centrale de Marseille .

  • Titre traduit

    Microscopie confocale à dichroïsme linéaire résolu en angle pour l'imagerie structurale de fluorescence


  • Résumé

    La microscopie de fluorescence a récemment été complétée par une technique appelée dichroïsme linéaire résolu angulairement, basé sur le fait que l'absorption de la lumière est un processus sensible à l'orientation moléculaire. En analysant la réponse d'émission de fluorescence en fonction de l'orientation de la polarisation de la lumière excitatrice, cette technique permet de remonter à l'information d'orientation sur un ensemble de molécules fluorescentes, plus précisément son angle d'orientation moyenne et l'amplitude de ses fluctuations angulaires autour de cette moyenne. Dans cette thèse, nous mettons en oeuvre de nouvelle méthodes et instrumentations capables d'améliorer la robustesse et la rapidité de l'analyse de données de réponses résolues en polarisation, la vitesse de l'acquisition de données, et d'explorer la possibilité de mesurer l'orientation 3D de molécules. Nous proposons une méthode capable de mesurer les propriétés d'orientation de sondes lipidiques fluorescentes par l'utilisation d'un disque de Nipkow couplé à une imagerie par caméra, et combiné avec la modulation rapide de la polarisation par modulateur électro-optique. Une nouvelle méthode de traitement de données est développée pour considérablement améliorer la rapidité et la précision de l'information par une étude des sources de bruit et d'incertitude, dues au bruit et aux facteurs instrumentaux. Cette technique a été testée avec succés sur des vésicules géantes uni-lamellaires et sur cellules vivantes, marquées par les sondes lipidiques DiIC18 et di-8-ANEPPQ. Cette méthode est capable d'acquérir une information précise sur l'orientation moléculaire à une cadence d'une image par seconde. Enfin, afin de sonder de manière non ambiguë l'orientation 3D d'un ensemble de molécules, une nouvelle méthode est proposée, supportée par des simulations numériques, basée sur la variation hors plan de la polarisation d'excitation dans le volume focal par une somme cohérente de champs polarisés linéairement et radialement.


  • Résumé

    Based on the fact that the absorption of light is a molecular-orientation sensitive process, fluorescence microscopy has been recently completed by a technique called angle-resolved linear dichroism. By analyzing the fluorescence emission response with respect to the polarization orientation of the exciting light, this technique allows retrieving orientation information of an ensemble of fluorescent molecules, namely the average orientation angle and the amplitude of the angular fluctuations around this average. In this PhD thesis, we implement new methods and instrumentation tools able to improve the robustness and speed of the polarization resolved data analysis, the rate of the data acquisition, and at last to explore the possibility to record molecular 3D orientation information. A scheme able to monitor the real-time orientation properties of fluorescent lipid probes is proposed using a high-speed spinning disk coupled to camera imaging, combined with fast switching of the polarization state by an electro optical modulator. A new data processing method is developed which considerably improves the speed and the precision of the retrieved information by investigating the sources of bias and uncertainty due to noise and instrumentation factors. The technique has been successfully tested on giant unilamellar vesicles and on living cells labeled with different fluorescent lipid probes, DiIC18 and di-8-ANEPPQ. It was able to acquire precise molecular orientation images at full frame rates in the range of one frame per second. At last in order to probe unambiguously the 3D orientation information of an ensemble of molecules, a new method is proposed and supported by simulations, based on the out-of-plane tuning of the excitation polarization realized in the focusing volume by coherently summing linearly and radially polarized fields.

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  • Détails : 1 vol. (125 p.)
  • Annexes : Bibliographie : 51 réf.

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