Synthèse de ligands à la proteine CARM1 pour l'étude de son activité enzymatique et la synthèse d'inhibiteurs sélectifs

Insights into CARM1 methylation : design of selective inhibitors and peptide mimics : a structure based approach

• Auteur / Autrice : Samira Ajebbar
• Direction : Alain Wagner
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie
• Date : Soutenance le 11/05/2012
• Etablissement(s) : Strasbourg
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences chimiques (Strasbourg ; 1995-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Conception et application de molécules bioactives (Strasbourg ; 2009-....)
• Jury : Président / Présidente : Jean-Jacques Bourguignon
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Paola Aromondo, Olivier Ploux

Mots clés

Mots clés contrôlés

Méthylation

Inhibiteurs

Arginine

Enzymes

Mots clés libres

Coactivor-associated arginine methyltransferase 1

PRMT4

Protéines arginines méthyltransférases

Analogues de la S-Adénosyl-L-méthionine

Histone

Modifications épigénétiques

Coactivor-associated arginine methyltransferase 1

PRMT4

SAM analogues

Protein arginine methyltransferases

Histone

Résumé

Les protéines arginine méthyl transférases ("PRMTs") sont impliquées dans de nombreux processus cellulaires essentiels. La protéine CARMI ("Coactivator-associated arginine methyltransferase 1", appelée aussi "PRMT4") a été initialement identifiée par sa fonction co-activatrice de la transcription impliquantplusieurs récepteurs nucléaires des hormones. CARMI est une enzyme qui catalyse la réaction de méthylation sur les histones via un donneur de méthyl naturel, la S-adénosY-L -méthionine (SAM). De nombreux travaux ont montré que CARMI est surexprimée dans les cancers du sein et de la prostate. L' objectif de ce travail est la compréhension à l'échelle moléculaire du mode d'action de CARMI et l'étude du mécanisme de reconnaissances moléculaires et de transferts d' informations gouvernés par la protéine CARMI. La structure cristallographique obtenue de cette enzyme en présence de cofacteur, la S-AdénosyhHomocystéine ou la Sinefungine a eu un effet stabilisant. Ainsi, notre stratégie a été de créer des molécules hameçons basées sur le motif de la SAM capables d' ancrer un peptide mimant la séquence de l' histone H3, pour ensuite les tester en co-cristallisation avec CARMI. Ainsi, grâce à la diffraction aux rayons X, les interactions mises en jeu dans le complexe CARMlImolécules hameçons/peptide pourront être déterminées. Cette stratégie s'est effectuée en trois étapes : la première étape, décrite dans le chapitre 2, a consisté en la synthèse d'analogues de la SAM obtenus grâce à des modifications réalisées autour de l'atome de soufre. Ces composés nous ont permis d' explorer la « poche du sulfonium ». Puis la seconde étape, décrite dans le chapitre 3, a été la synthèse • d'analogues de bisubstrats nécessaires pour l'exploration de la « poche de l'arginine ». Dans une dernière étape, décrite dans les chapitres 4 et 5, nous avons abordé la synthèse d'adduits SAM-peptide pouf pouvoir étudier le « domaine de fixation du peptide ». Dans le quatrième chapitre, la méthode de choix est la création d'un lien covalent entre une molécule hameçon électrophile etun peptide par chimie de click in-situ : par réaction de cycloaddition de Huisgen; par réaction entre des molécules hameçons électrophiles capables de piéger un peptide cystéine ou un peptide arginine. Ces essais se sont révélés infructueux et une nouvelle stratégie a été employée en utilisant des molécules ancres. Dansle cinquième chapitre des molécules ancres ont donc été préformés pour ensuite être testés en cocristallisation dans CARMl.

Protein aginine methyltransferases (PRMTs) have been implicated in a variety of biological processes. Coactivator-associated arginine methyltransferase 1 (CARM1 , also known as PRMT4) was identified as an enhancer of the transcriptional activation by several nuclear hormone receptors CARM1 is an enzyme which methylates the arginines of histones via a natural methyl donor, the SAdenosyh-Methionine (SAM). Recent studies have shown that CARM-1 is over-expressed in breastumors and in hormone dependent prostate tumors. The goal of this work is to understand at the molecular level the mode of binding of substrate/product arginine-containing peptides, reflectingstates prior and subsequent to methylation and the detailed mechanism of action of this protein. Several crystal structures of the catalytic domain of CARM1 have shown that cofactor-binding, such as S-Adenosyl-L -Homocysteine or sinefungin, produces large conformational changes in the catalytic domain. These crystal structures clearly illustrate that SAM binding is a prerequisite for peptide binding and build up the productive peptide binding site. Our strategy was to design fishhook molecules derivatives of the SAM capable of anchoring a mimic peptide of the histone H3 in order to test the co-crystallization in CARM1. Consequently, thanks to X-Ray structure, interactions involvement in the complexe CARM1/fishhook molecule/peptide could be determined. This strategy was do ne in three steps: the first one, described in the chapter 2, consisted in synthesizing SAManalogues with several modifications around sulfur atom. These compounds permitted to explore the "sulfonium pocket". The second step, described in chapter 3, consisted in synthesizing analogues of bisubstrats to explore "arginine binding pocket". Finally, the last step, described in the chapter 4 and 5, consisted in synthesizing SAM-peptide adducts to study "peptide binding domain". ln the chapter 4, the chosen method is the creation of covalent link between this molecule and a peptide by click chemistry in-situ: by reaction of Huisgen's cycloaddition; by reaction between electrophilic fishhook molecules capable of capturing with a cystein or arginine peptides. Unfortunately, ail of these trials have been unsuccessful. Consequently SAM-peptide adducts were performed to be co-crystallized in CARM1. This part was described in the last chapter.